旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白對膿毒癥誘發(fā)的小鼠心肌損傷有保護作用

膿毒癥是宿主感染病原生物后機體大量釋放炎癥因子，致使免疫調(diào)節(jié)失控而引發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，可造成感染性休克及多臟器功能衰竭。膿毒癥及其誘發(fā)的器官損傷已成為嚴(yán)重危害人類健康的棘手難題。作為人體的核心器官，心肌損傷是重癥膿毒癥最常見的可逆性并發(fā)癥狀，主要體現(xiàn)為左心室收縮和舒張功能障礙。流行病學(xué)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，超過半數(shù)以上的膿毒癥病人會伴發(fā)心功能障礙，致使預(yù)后變差，病死率達(dá)到80%左右，因此，有效防治膿毒癥心肌損傷已成為控制疾病進(jìn)展，改善患者預(yù)后的研究重點。

近年來，針對“蠕蟲療法”保護炎癥性疾病的研究逐漸增多。蠕蟲及其排泄分泌蛋白具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性，可通過誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞活化調(diào)控宿主免疫應(yīng)答。這種調(diào)控一方面能幫助蠕蟲躲避宿主的抗蟲免疫打擊，營造便于其長久寄生的環(huán)境，另一方面又能減輕過度抗蟲免疫而引發(fā)的組織器官傷害，有利于機體建立免疫耐受?！靶l(wèi)生假說”提出，蠕蟲感染率下降對機體免疫系統(tǒng)發(fā)育存在負(fù)面影響，可加大免疫相關(guān)性疾病的患病幾率。有文獻(xiàn)報道，蠕蟲及蠕蟲來源蛋白對糖尿病、多發(fā)性硬化癥、過敏性鼻炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腦脊髓炎及代謝綜合征等多種免疫失調(diào)性疾病均有保護作用，這種保護作用是多種免疫細(xì)胞共同參與調(diào)控的結(jié)果，例如樹突狀細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，主要表現(xiàn)為抑制白介素6（IL-6）和白介素1β（IL-1β）等炎性因子分泌，并促進(jìn)白介素10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子分泌。另有文獻(xiàn)報道，蠕蟲排泄分泌蛋白對膿毒癥也具有良好的保護作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，源自日本血吸蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑Sj-Cys有效緩解了膿毒癥誘發(fā)的心肌損傷，表明蠕蟲衍生蛋白具有保護膿毒癥心肌損傷的潛力。

已有文獻(xiàn)表明，旋毛蟲（）和旋毛蟲排泄分泌蛋白可以有效緩解風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、哮喘等病變的炎癥反應(yīng)。且有研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲排泄分泌蛋白對膿毒癥誘發(fā)的肝、腎及肺臟損傷均具有保護作用，目前旋毛蟲排泄分泌蛋白對膿毒癥誘發(fā)心肌損傷的影響還未見報道，本實驗選用抗炎效果明確的臨床膿毒癥用藥地塞米松作為陽性對照，探討旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白Ts-MES對膿毒癥心肌損傷的影響，并分析其免疫機制，以期為蠕蟲及蠕蟲來源蛋白保護膿毒癥及其誘發(fā)的器官損傷提供理論支持和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 7～9 周齡雄性BALB/c 小鼠，體質(zhì)量20～23 g，由河南斯克貝斯生物公司提供。

1.1.2 蟲株 安徽省感染與免疫重點實驗室昆明鼠傳代保種的河南豬源旋毛蟲。

1.2 主要試劑和儀器

昌樂火山國家地質(zhì)公園2013年被住建部確定為國家自然遺產(chǎn)，2014年初被國土資源部確定為國家地質(zhì)公園。近年來，昌樂縣積極開發(fā)利用遠(yuǎn)古火山資源，正在規(guī)劃建設(shè)“兩山一帶三組團”的旅游產(chǎn)業(yè)發(fā)展格局，“兩山”，即昌樂遠(yuǎn)古火山地質(zhì)公園和蓮花山農(nóng)莊小鎮(zhèn)，“一帶”，即火山鄉(xiāng)村旅游帶；“三組團”，即西部“古火山小鎮(zhèn)”組團、南部山地休閑度假組團、北部現(xiàn)代休閑農(nóng)業(yè)與宗教文化組團。

1.3 實驗方法

1.3.1 旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白（Ts-MES）的收集和鑒定 依照文獻(xiàn)［25］的方法富集旋毛蟲肌幼蟲，將肌幼蟲置于不含血清的RPMI 培養(yǎng)基中孵育，48 h后吸取上清，超濾膜予以濃縮，SDS?PAGE鑒定蛋白成分，測定蛋白濃度后-80 ℃冷凍保存。

1.3.4 超聲心動圖評估心功能 術(shù)后12 h，依據(jù)文獻(xiàn)［25］的方式，進(jìn)行M模超聲心動圖檢測，以乳頭肌為參照觀察左心室運動狀況，記錄心率、每搏輸出量、收縮期左室內(nèi)徑、舒張期左室內(nèi)徑、收縮期左室容積、舒張期左室容積等指標(biāo)數(shù)據(jù)，選取3個連續(xù)心動周期取均值計算左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室縮短率（LVFS），以評價左心室收縮功能。血流多普勒模式下分別檢測二尖瓣舒張早期血流速度（E）和舒張晚期血流速度（A），選取3個連續(xù)心動周期取均值計算E/A比，以評估左心室舒張功能。

1.3.3 實驗動物分組及干預(yù) 80只雄性BALB/c小鼠隨機分為4組，各組20只，分別為假手術(shù)組（A組）、心肌損傷模型組（B組）、Ts-MES治療組（C組）和地塞米松對照組（D組）。B、C、D組經(jīng)CLP法構(gòu)建膿毒癥心肌損傷動物模型，A組只行開腹探尋，不結(jié)扎和穿刺盲腸。術(shù)后40 min，A、B兩組小鼠腹腔注射150 μL PBS，C組腹腔注射含有20 μg Ts-MES的等量PBS，D組腹腔注射含地塞米松（0.3 mg/kg）的等量PBS，劑量參考文獻(xiàn)［24］。每組隨機抽取6只小鼠在術(shù)后12 h進(jìn)行超聲心動圖檢測，另隨機抽取8只小鼠用于觀測72 h生存率，剩余的6只小鼠術(shù)后12 h麻醉后收集眼球血和心臟。

1.3.2 膿毒癥心肌損傷小鼠模型的構(gòu)建 利用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）法構(gòu)建膿毒癥心肌損傷小鼠模型。手術(shù)前12 h禁食，不禁水。腹腔麻醉后固定四肢，剃除腹部皮毛并消毒，從腹白線處按層次剪開，做一長約1.0 cm的腹部開口，腹腔探查尋找盲腸并輕柔地牽出體外，在距離盲腸末端約0.8 cm處用4-0外科縫線結(jié)扎，使用18號穿刺針在已經(jīng)結(jié)扎的盲腸上避開血管進(jìn)行對穿，輕輕擠出少許糞便后將盲腸復(fù)位，按層次縫合腹壁后消毒。每只小鼠術(shù)后經(jīng)皮下注射給予0.5 mL生理鹽水增補體液，正常飲食飼養(yǎng)。所有動物實驗均按照蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物管理和倫理委員會批準(zhǔn)的方案進(jìn)行，倫理編號：［2021］第189號。

與總體回歸結(jié)果相同，RTA簽訂質(zhì)量對經(jīng)濟增長的推動作用要顯著大于RTA數(shù)量的作用，且法定承諾率的經(jīng)濟增長效應(yīng)略大于條款覆蓋率的經(jīng)濟增長效應(yīng)，即RTA的質(zhì)量比數(shù)量更有效，越嚴(yán)格執(zhí)行協(xié)議質(zhì)量對經(jīng)濟增長的影響效果越大。這其中相對于發(fā)展中國家而言，發(fā)達(dá)國家簽訂高質(zhì)量的RTA更能有效推進(jìn)經(jīng)濟增長。

1.4.1 血清細(xì)胞因子的檢測 術(shù)后12 h，麻醉小鼠后采集血清，參照ELISA試劑盒說明書，分別檢測血清中NTPro-BNP、cTnI、TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β的水平。

1.4 標(biāo)本的采集和檢測方法

圖3中給出了全仿真運行時序。H1是故障首次發(fā)生的點，通常需要4個周期才能清楚主保護斷路器的故障。當(dāng)初級電弧在H2處被消除時，次級電弧電流開始流過故障點。在H4處對次級電弧進(jìn)行滅弧，兩個相在H3處的250 ms（從時間零起）跳閘，即在初級電弧消除之后的10個周期。

首先對于道路橋梁施工圖紙進(jìn)行充分的熟和了解，同時詳細(xì)的了解伸縮縫施工的操作流程以及需要注意的細(xì)節(jié)，根據(jù)工程施工的實際情況制定出施工方案并報告給相關(guān)部分經(jīng)檢查合格之后再進(jìn)行施工。同時對于施工人員應(yīng)該明確每一個施工人員的工作任務(wù)以及工作責(zé)任，將施工中所使用的機械設(shè)備進(jìn)行合理的分配，并對所有設(shè)備進(jìn)行必要的測試，確?？梢哉Ｊ褂?，嚴(yán)格對每一道施工工序進(jìn)行監(jiān)管，避免出現(xiàn)質(zhì)量問題。

1.4.2 心肌組織病理學(xué)觀察 術(shù)后12 h進(jìn)行心臟取材，將取下的心臟置于預(yù)冷至4 ℃的PBS液中，在左心耳處剪開，PBS灌洗心腔。剪取心尖部分，石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE染色，鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)變化。參考文獻(xiàn)［26］進(jìn)行心臟組織病理學(xué)損傷評分，每例玻片隨機選擇5個400×視野，根據(jù)每個視野下?lián)p傷（心肌纖維水腫、變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤）累及范圍占總視野百分比計分：0分，無累及；1 分，＜25%；2 分，25%～50%；3 分，50%～75%；4分，＞75%，根據(jù)5個視野下?lián)p傷評分的均值評價每例樣本的心肌損傷程度。

目前，我國鄉(xiāng)村旅游電子商務(wù)的發(fā)展處于自發(fā)式發(fā)展階段，缺乏有效的統(tǒng)一戰(zhàn)略規(guī)劃，雖然部分地區(qū)對鄉(xiāng)村旅游資源的開發(fā)開展了規(guī)劃和設(shè)計，但項目難以落地，項目大量存在低質(zhì)開發(fā)、基礎(chǔ)設(shè)施重復(fù)建設(shè)、旅游模式與產(chǎn)品模式雷同、破壞鄉(xiāng)村環(huán)境等不良現(xiàn)象。鄉(xiāng)村旅游資源得不到充分挖掘，開發(fā)模式缺少地方文化內(nèi)涵，特色不明顯，形成千篇一律的發(fā)展模式。

地塞米松磷酸鈉（博萊藥業(yè)，5 mg/mL）；蘇木素染色液（Baso）；TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β ELISA試劑盒（達(dá)科為）；NTPro-BNP、cTnI ELISA 試劑盒（Elab science）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher）；SYBR預(yù)混液及TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β、GAPDH 基因檢測上、下游引物（Sangon Biotech）；酶標(biāo)儀Model550（Bio-Rad）；超聲心動圖儀Vevo 2100（Visualsonics）；熒光定量PCR儀Light Cycler 96 SW1.1（Roche）。

1.4.3 心肌組織中細(xì)胞因子的檢測 參照文獻(xiàn)［17］利用Trizol法提取心肌組織中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行qRT-PCR檢測，比較各組小鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、IL-10及TGF-β的表達(dá)量。引物設(shè)計如表1。

心臟超聲心動圖檢測表明（圖3），和A組相比，B組小鼠的LVEF、LVFS、E/A比均顯著降低（＜0.001）。和B組相比，C、D兩組小鼠心臟的收縮和舒張功都有明顯好轉(zhuǎn)，LVEF、LVFS、E/A比均顯著升高（＜0.01）。

1.4.4 72 h生存率評估 術(shù)后定時觀察小鼠的精神、活動和飲食情況，準(zhǔn)確記錄各時段每組小鼠的生存狀況并制作生存曲線。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用GraphPad Prism 5軟件，全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，生存率估計用Kaplan-Meier法，生存曲線比較用Log-rank法，多組數(shù)據(jù)比較采用one-way ANOVA法，＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ts-MES的SDS?PAGE鑒定結(jié)果

A組小鼠術(shù)后精神、活動和飲食情況均正常，100%存活；B組小鼠術(shù)后萎靡不振，皮毛豎起，角落抱團，不活動或少活動，主動進(jìn)食極少，72 h生存率為0%；C組和D組小鼠的整體生存狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，72 h生存率分別為37.5%和50%，相比B組顯著上升（＜0.05，圖2）。

2.由原來的以審批為重心轉(zhuǎn)向以規(guī)則制定為重心。各級監(jiān)管部門從規(guī)范政府采購各方當(dāng)事人行為出發(fā)，陸續(xù)制定了一系列具體實施辦法和針對本地政府采購工作實際的管理辦法。如政府采購工作規(guī)程、政府采購項目開標(biāo)評標(biāo)現(xiàn)場監(jiān)督管理暫行辦法、政府采購評審專家管理實施辦法、政府采購代理機構(gòu)管理暫行辦法等。這些辦法都明確了各方當(dāng)事人不能觸碰的紅線。例如，自2018年3月1日起實施的《政府采購質(zhì)疑和投訴辦法》，在原有辦法規(guī)定的基礎(chǔ)上增加了供應(yīng)商虛假、惡意投訴或在全國范圍12個月內(nèi)三次以上投訴查無實據(jù)的，由財政部門列入不良行為記錄名單。

2.2 Ts-MES對膿毒癥心肌損傷小鼠生存率的影響

Ts-MES是含有多種蛋白組分的雜蛋白，在SDSPAGE分離和考馬斯亮藍(lán)著色后可見20條蛋白條帶，其中主要條帶有11條，相對分子質(zhì)量在10 000～142 000之間（圖1）。

2.3 Ts-MES對膿毒癥心肌損傷小鼠心功能的影響

陰莖與陰囊、陰阜之間的夾角稱為陰莖角，包括陰莖陰囊角和陰莖陰阜角。包莖：陰莖體外顯正常，遠(yuǎn)端包皮外口窄小，無法翻開顯露龜頭，呈柱狀外觀，陰莖角為直角。隱匿陰莖：顯露不良，陰莖角呈鈍角(圖2)。包莖和隱匿陰莖兩者陰莖體發(fā)育均正常，只是顯露有差異(圖3)。

2.4 Ts-MES對膿毒癥心肌損傷小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)的影響

HE染色顯示（圖4），和A組相比，B組小鼠的心肌細(xì)胞明顯腫脹，肌纖維間隙變寬，排布紊亂，伴有炎細(xì)胞浸潤，病理損傷評分明顯升高（＜0.001）。與B組相比，C 組和D 組小鼠心肌病理損傷評分均明顯降低（＜0.001），心肌細(xì)胞腫脹程度減輕，肌纖維間隙縮小，炎細(xì)胞浸潤減少。

2.5 Ts-MES對小鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示（圖5），和A組相比，B組小鼠血清中NTPro-BNP和cTnI水平明顯升高（＜0.01），和B組相比，C、D兩組小鼠血清中NTPro-BNP和cTnI水平均明顯下降（＜0.05）。

2.6 Ts-MES對膿毒癥心肌損傷小鼠血清中細(xì)胞因子水平的影響

ELISA 法測定各組小鼠血清中促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6）和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子（IL-10、TGF-β）的表達(dá)情況（圖6），B組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平較A組明顯升高（＜0.001），C、D兩組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平較B組明顯下降（＜0.05）。同時，C組小鼠血清中IL-10和TGF-β水平較B組明顯升高（＜0.05），而D組小鼠血清IL-10和TGF-β水平較B組雖有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.7 Ts-MES對膿毒癥心肌損傷小鼠心肌組織中細(xì)胞因子水平的影響

B組小鼠心肌組織中TNF-α和IL-6表達(dá)量較A組顯著升高（＜0.001），C、D兩組小鼠心肌組織中TNF-α和IL-6表達(dá)量較B組均顯著降低（＜0.01），同時，C組小鼠心肌組織中IL-10和TGF-β表達(dá)量較B組顯著升高（＜0.01），而D組小鼠心肌組織中IL-10和TGF-β表達(dá)量較B組雖有增加趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異（圖7）。

3 討論

本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，采用CLP法誘導(dǎo)膿毒癥模型，并在膿毒癥模型基礎(chǔ)上，借助心臟超聲、血清心肌損傷因子檢測等方法篩選出穩(wěn)定的心肌損傷小鼠，并以抗炎效果明確的臨床膿毒癥用藥地塞米松作為陽性對照，觀察旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白Ts-MES對膿毒癥心肌損傷小鼠的影響。實驗結(jié)果表明，在CLP術(shù)后12 h，相比A組（假手術(shù)組），B組（模型組）小鼠心肌細(xì)胞明顯腫脹、間隙變寬、排布紊亂并有炎癥細(xì)胞浸潤，超聲心動圖檢測顯示，小鼠左室收縮功能指標(biāo)LVEF、LVFS和左室舒張功能指標(biāo)E/A比均明顯下降，且血清中心肌損傷因子NTPro-BNP和cTnI的表達(dá)明顯升高，這說明CLP法誘導(dǎo)的膿毒癥已對小鼠心肌構(gòu)成顯著傷害，疾病模型構(gòu)建成功。

眾所周知，炎性細(xì)胞因子在膿毒癥疾病進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用，是引發(fā)器官功能損傷的根本原因，膿毒癥初始階段，以TNF-α和IL-6為代表的炎性介質(zhì)大量合成，并啟動炎癥級聯(lián)效應(yīng)，刺激心血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生過量的一氧化氮合酶iNOS，引發(fā)膿毒癥心肌損傷，表現(xiàn)為心臟炎性細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞肥大腫脹，心臟收縮和舒張功能受損。在膿毒癥環(huán)境下，心肌細(xì)胞自身也可釋放TNF-α和IL-6，這進(jìn)一步加劇了心肌損傷的嚴(yán)重程度。本實驗發(fā)現(xiàn)，與A組對比，B組小鼠心肌細(xì)胞明顯腫脹、間隙變寬、排布紊亂并有炎癥細(xì)胞浸潤，這與該組小鼠外周血清和心肌組織中TNF-α、IL-6表達(dá)量的顯著增加關(guān)系密切。在分別給予Ts-MES和小劑量地塞米松治療后，C、D兩組小鼠血清和心肌組織中TNF-α、IL-6的表達(dá)量均顯著下降，心肌病理損傷得到明顯緩解，血清中NTPro-BNP、cTnI水平顯著下降，LVEF、LVFS及E/A比顯著回升，心臟收縮功能和舒張功能明顯好轉(zhuǎn)，小鼠術(shù)后72 h 生存率分別可達(dá)37.5%和50%，明顯高于B組（0%）。以上結(jié)果表明，Ts-MES通過下調(diào)促炎細(xì)胞因子表達(dá)緩解了膿毒癥心肌損傷，與小劑量地塞米松效果相似。從以往文獻(xiàn)可知，旋毛蟲排泄分泌物主要是通過激活宿主調(diào)節(jié)性Tregs參與免疫調(diào)控，活化的Tregs可增加IL?10和TGF?β等調(diào)節(jié)性因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。本實驗發(fā)現(xiàn)，和B組相比，Ts-MES治療后的C組小鼠血清和心肌組織中IL-10、TGF-β表達(dá)量均顯著升高，說明在炎癥狀態(tài)下，Ts-MES可能刺激Tregs活化并誘導(dǎo)了IL?10、TGF?β等調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子表達(dá)。

綜上所述，Ts-MES通過調(diào)節(jié)膿毒癥心肌損傷小鼠的系統(tǒng)免疫和心臟局部免疫，抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，并促進(jìn)調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL?10和TGF?β的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制性免疫調(diào)節(jié)功能，緩解了膿毒癥誘發(fā)的心肌損傷，這與旋毛蟲排泄分泌蛋白對膿毒癥性肝、腎及肺臟損傷的保護機制具有一致性。