柚皮總黃酮不同提取方法的比較*

葉燊茹，簡梓晴，徐毅鋒，葉偉璇，李海彬，羅 蘭

(廣州新華學院藥學院，廣東 廣州 510520)

柚(Citrusmaxima(Burm.)Merr.)，為蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)水果，在我國的栽培歷史悠久，品種繁多，資源豐富。柚全身都是寶，除果肉有豐富的營養(yǎng)和藥用價值外，果皮和果核也具有較高的藥用價值和重要的生物學功能[1-2]。目前柚主要以果肉鮮食為主，約占整個柚子總量40%～50%[3]的柚皮卻多被丟棄，這不僅造成環(huán)境負擔，更使柚皮中的特色次級代謝產(chǎn)物沒有得到充分開發(fā)，導致嚴重的資源浪費現(xiàn)象。

已有研究報道，柚皮中黃酮類化合物含量豐富，其生物活性主要表現(xiàn)在抗氧化、抗病毒、降血糖、降血脂、降膽固醇、提高免疫力等，具有較高的保健和藥用價值[4-5]。將廢棄柚皮中黃酮類化合物進行提取利用，可為其后續(xù)全面開發(fā)及下游產(chǎn)品深加工提供科學數(shù)據(jù)，促進香精香料、食品添加劑、天然抗氧化劑、抗菌劑及降血糖功能食品等工業(yè)的發(fā)展[6-9]。

目前，對柚皮中總黃酮的提取方法，主要有超聲法、利用酶的提取法、微波萃取法，其中以微波法和超聲波法的研究居多[10-13]，但對柚皮中總黃酮提取方法進行比較的相關(guān)研究較少。因柚子品種品系繁多，其黃酮類成分含量不一，各文獻提取方法所得的總黃酮提取率相差很大。綜上，本研究以廣西容縣沙田柚柚皮為原材料，比較超聲法、纖維素酶輔助法、微波消解法對總黃酮的提取率，得出最佳提取方法，并優(yōu)化提取方法的工藝條件,為柚皮黃酮類化合物的研究和應用提供參考依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試 藥

柚皮(45 ℃下干燥后粉碎,廣西省容縣)；蘆丁對照品(批號：191207，純度：98%,中國藥品生物制品檢定所)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95%乙醇等試劑均為分析純，所用水為純化水。

1.2 儀 器

UV-2201紫外可見分光光度計，日本島津公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MARS6微波消解儀，CEM廠家；DFT-50型號手提式高速萬能粉碎機。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取蘆丁對照品50 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解完全，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取10 mL，置100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液。

2.2 樣品溶液的制備

精密稱取柚皮粉末2 g，置50 mL具塞錐形瓶中。分別采用超聲法、纖維素酶輔助法和微波消解法進行提取，提取完畢后過濾，即得樣品溶液。

2.3 蘆丁標準曲線的繪制

精密量取蘆丁對照品母液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，照上法配置無對照溶液的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在500nm波長處測定吸光度。吸光度為縱坐標(y)，蘆丁濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線，得回歸方程為y=10.443x+0.0015，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，表明蘆丁在檢測濃度范圍內(nèi)線性良好，蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Rutin standard curve

2.4 柚皮總黃酮提取率的測定

吸取3 mL樣品溶液,按“2.3”項下方法進行吸光度的測定。再根據(jù)蘆丁標準曲線計算樣品中總黃酮的含量，通過以下公式計算樣品中總黃酮的提取率。

式中:X為提取率,%；C為被測液中總黃酮的含量,mg/mL; W為樣品的質(zhì)量,g; D為稀釋倍數(shù)；V為溶劑體積,mL。

2.5 超聲法提取

2.5.1 單因素的考察

以柚皮總黃酮提取率為指標, 乙醇濃度(30%、45%、60%、75%、90%)、料液比(g:mL)(1:5、1:10、1:15、1:20、1:25)、提取時間(20、30、40、50、60 min)和提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)為考察因素進行單因素實驗，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲法單因素實驗結(jié)果Fig.2 Single factor experiment results of ultrasonic method

由圖2可知，當料液比為1:15(g:mL)時,提取率達最大值。若溶劑量過少，總黃酮未充分溶解于乙醇；溶劑量增加則柚子皮粉末與溶劑的接觸面增大，利于總黃酮的提??；而加入過多溶劑會導致物料吸收的超聲能減少，總黃酮溶出不充分。柚子皮總黃酮提取率隨提取時間的增加而上升，在50 min時提取率出現(xiàn)最高點。隨著提取溫度的增大，提取率先增大后減小,在60 ℃時提取率達峰值。提取溫度過高乙醇易揮發(fā)，還可導致黃酮成分發(fā)生變化，分子結(jié)構(gòu)受到破壞，從而降低總黃酮得率[14]。若乙醇濃度過小則部分水溶性雜質(zhì)溶出，從而導致總黃酮提取率降低，因此隨著乙醇濃度的不斷增大，其提取率呈上升趨勢。

2.5.2 正交試驗

表1 超聲法正交試驗因素和水平Table 1 Factors and level of orthogonal test of ultrasonic method

表2 超聲法 L9(34)正交試驗結(jié)果(直觀分析)Table 2 Ultrasonic method L9(34) orthogonal test results (intuitive analysis)

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取率為考察指標，對提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度進行正交試驗，正交試驗因素和水平如表1所示，正交試驗結(jié)果與分析如表2、表3所示。

由正交試驗直觀分析結(jié)果可知，四個因素對總黃酮提取率影響的主次順序為：提取溫度>乙醇濃度>提取時間>料液比。從方差分析結(jié)果可以看出，四個因素對提取率均無顯著性影響。結(jié)合直觀分析和方差分析，篩選出超聲法提取柚皮總黃酮的最佳工藝條件為A2D1B2C3，即稱取柚皮粉末，以1:25的料液比加入60%乙醇，在60 ℃下超聲提取50 min。

表3 超聲法正交試驗方差分析結(jié)果Table 3 Results of ultrasonic orthogonal test variance analysis

2.6 纖維素酶輔助法提取

2.6.1 單因素的考察

以柚皮總黃酮提取率為指標, 酶解溫度(10、20、30、40、50 ℃)、pH(3.5、4、4.5、5、5.5)、酶解時間(20、25、30、35、40 min)和纖維素酶用量(2.0、4.0、6.0、8.0、10 mg/g)為考察因素進行單因素實驗，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，溶液pH為5.0時，總黃酮提取率最高,說明纖維素酶在pH5.0溶液中活性最大，利于總黃酮溶出。pH增大，纖維素酶的酶解能力下降，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)的作用降低，導致總黃酮提取率降低。酶解溫度在10～50 ℃范圍內(nèi),總黃酮的提取率先增大后減小，溫度達到40 ℃時，總黃酮提取率達最高值。酶解溫度逐漸升高，酶活性也隨之增大，對原料作用越充分，提取率越高；當溫度超出纖維素酶的最適作用溫度時，酶的活性會降低，從而使得總黃酮提取率降低。酶解時間在35 min時提取率達最大值，當提取時間增大至40 min時提取率下降?？傸S酮提取率隨酶用量的增加而增大,用量達6 mg/g時提取率達最大值0.93%。酶用量繼續(xù)增加，提取率下降。當總黃酮成分在溶劑中的擴散達到平衡狀態(tài)時提取過程已經(jīng)完成，再增加酶用量或延長提取時間，不僅導致雜質(zhì)溶出增加，還增大了已溶出的總黃酮成分的降解風險。

圖3 纖維素酶輔助法單因素實驗結(jié)果Fig.3 Results of single factor experiment with cellulase-assisted method

2.6.2 正交試驗

表4 纖維素酶輔助法正交試驗因素和水平Table 4 Factors and levels of cellulase-assisted orthogonal test

表5 纖維素酶輔助法L9(34)正交試驗結(jié)果(直觀分析)Table 5 Cellulase-assisted method L9(34) orthogonal test results (intuitive analysis)

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取率為觀察指標，對pH、酶解溫度、酶解時間、纖維素酶用量進行正交試驗，正交試驗因素和水平如表4所示，正交試驗結(jié)果與分析如表5、表6所示。

表6 纖維素酶輔助法正交試驗方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis of orthogonal test by cellulase-assisted method

由纖維素酶輔助法正交試驗直觀分析結(jié)果可知，四個因素對柚子皮黃酮提取率影響的主次順序為:酶解溫度>pH>酶解時間>酶用量。從方差分析結(jié)果可以看出，四個因素對提取率均無顯著性影響。結(jié)合直觀分析和方差分析，篩選出超聲法提取柚皮總黃酮的最佳工藝條件為B3A3C2D1,即稱取柚皮粉末，加入60%乙醇(調(diào)節(jié)pH至5.0)，加入4 mg/g的纖維素酶在50 ℃下提取35 min。

2.7 微波消解法提取

2.7.1 單因素的考察

以柚皮總黃酮提取率為指標, 乙醇濃度(55、65、75、85、95%)、提取溫度(60、70、80、90、100 ℃) 、輻射時間(5、10、15、20、25 min)、料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)為考察因素進行單因素實驗，結(jié)果見圖4。

圖4 微波消解法單因素實驗結(jié)果Fig.4 Single factor experiment results of microwave digestion method

由圖4可知，隨著乙醇濃度升高，總黃酮提取率不斷增大，在乙醇濃度為85%時有最大提取率。繼續(xù)增大乙醇濃度，總黃酮提取率下降?？傸S酮提取率在60～100 ℃范圍內(nèi)先增大后減小，70 ℃時提取率達最大值。當溫度繼續(xù)升高時，總黃酮成分被破壞，乙醇嚴重揮發(fā)，導致其提取率下降。隨著提取時間的增大，總黃酮提取率逐漸升高，提取時間在20 min時提取率最高。將提取時間增加至25 min，總黃酮提取率下降。微波作用促進了總黃酮的溶解,但微波作用時間過長對總黃酮成分造成破壞的可能性增大[15]。隨著乙醇量增加,提取率逐漸減小。在一定范圍內(nèi)增加溶劑量有利于總黃酮成分溶出，但料液比過大將導致在后續(xù)的操作中損失溶質(zhì)，從而降低提取率。

2.7.2 正交試驗

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取率為觀察指標，對乙醇濃度、提取溫度、輻射時間、料液比進行正交試驗，正交試驗因素和水平如表7所示，正交試驗結(jié)果與分析如表8、表9所示。

表7 微波消解法正交試驗因素和水平Table 7 Factors and level of microwave digestion orthogonal test

表8 微波消解法L9(34)正交試驗結(jié)果(直觀分析)Table 8 Microwave digestion L9(34) orthogonal test results (intuitive analysis)

表9 微波消解法正交試驗方差分析結(jié)果Table 9 Microwave digestion method orthogonal test variance analysis results

由微波消解法正交試驗直觀分析結(jié)果可知，四個因素對柚子皮黃酮提取率影響的主次順序為:乙醇濃度> 提取溫度>輻射時間>料液比。從方差分析結(jié)果可以看出，四個因素對提取率均無顯著性影響。結(jié)合直觀分析和方差分析，篩選出超聲法提取柚皮總黃酮的最佳工藝條件為A3B2C1D3,即稱取柚皮粉末，按料液比1:20(g:mL)加入85%乙醇，在70 ℃下微波提取10 min。

2.8 不同提取方法的驗證及結(jié)果比較

通過研究不同提取方法對柚皮中總黃酮提取率的影響，采用正交試驗對不同的提取方法進行優(yōu)化，并進行驗證試驗。結(jié)果表明：在超聲法中，提取溫度60 ℃、提取時間50 min、料液比1:25(g:mL)，此條件下柚皮總黃酮提取率為1.04%；纖維素酶輔助法中，pH 5.0、料液比酶解溫度50 ℃、酶解時間35 min，此條件下柚皮總黃酮提取率為1.10%；微波消解法中，料液比1:20(g:mL)、乙醇濃度85%，提取溫度70 ℃、提取時間10 min，此條件下柚皮總黃酮提取率為1.25%。由結(jié)果可知三種方法提取油皮總黃酮的提取率為微波消解法>纖維素酶輔助法>超聲法，如圖5所示。

圖5 不同提取方法的驗證及結(jié)果比較Fig.5 Verification of different extraction methods and comparison of results

3 討 論

微波消解法提取時內(nèi)外同時加熱，受熱均勻，可使反應充分，從而提取率較高，是一種快速、高效、節(jié)能且實用的新型工藝[16-17]。本研究實驗結(jié)果表明，微波消解法以最佳工藝提取總黃酮的得率為1.25%，與傳統(tǒng)工藝相比，微波消解法提取柚皮總黃酮不僅節(jié)約提取時間，且提取率較高，此法對于擴大工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的現(xiàn)實意義。與現(xiàn)有的微波消解法提取黃酮文獻研究相比，本研究中微波消解法下柚皮總黃酮的提取率較高，可能是因為沙田柚原產(chǎn)地廣西容縣所產(chǎn)的柚皮黃酮類成分較高。

纖維素酶輔助法是運用酶反應的高度專一性，從而對細胞壁進行破壞，使胞內(nèi)黃酮化合物溶出。提高該方法提取率的關(guān)鍵在與如何控制好適合酶解溫度及酸堿度。由本實驗得該法在pH 5.0、加入4 mg/g的纖維素酶在50 ℃下提取35 min所得的提取率最高，為1.10%，相對于微波消解法較低，原因為受熱均勻程度不及微波加熱，且纖維酶活性較低，反應條件較難控制，制約了提取效率，且纖維素酶在實驗成本中相對較高，因此選擇微波消解法優(yōu)于纖維酶輔助法。

超聲提取法利用超聲波的空化作用，產(chǎn)生振動加速柚皮胞內(nèi)黃酮的釋放，該法適用范圍廣泛，且無需特殊裝置，操作簡單，快速高效，與傳統(tǒng)的提取方法如冷浸法、回流法相比在時間上有所縮短。但在此次試驗中，最佳提取條件在提取溫度60 ℃、提取時間50 min、料液比1:25(g:mL)，此條件下柚皮總黃酮提取率為1.04%，提取時間比前兩種方法都較長，且提取效率不及前兩者高，考慮提取效率的情況下更推薦使用微波消解法。

本研究以廣西容縣沙田柚柚皮為原料，比較了超聲法、纖維素酶輔助法、微波消解法下柚皮總黃酮的提取率，得出最佳提取方法及工藝路線，即以料液比1:20(g:mL)、乙醇濃度85%，提取溫度70 ℃、提取時間10 min為條件進行微波消解法提取，該方法簡單、快速、高效，可為柚皮總黃酮類化合物在食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的提取和應用提供參考依據(jù)。