己酸菌富集及其利用餐廚垃圾產(chǎn)己酸的研究

張艷艷,白佳喆,左劍惡,*

己酸菌富集及其利用餐廚垃圾產(chǎn)己酸的研究

張艷艷1,白佳喆2,左劍惡1,2*

(1.清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院,環(huán)境模擬與污染控制國家重點(diǎn)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,北京 100084；2.清華大學(xué)深圳國際研究生院,廣東 深圳 518055)

采用批式發(fā)酵的方式,考察3種不同電子供體(乙醇、乳酸、乙醇和乳酸)對己酸菌的富集情況,進(jìn)而選取產(chǎn)己酸最優(yōu)的混合菌,探究在不外加電子供體情況下,餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)己酸的性能.結(jié)果表明:當(dāng)以乙醇和乳酸共同作為電子供體時(shí),己酸濃度可達(dá)(2303.06±499.56)mgCOD/L,產(chǎn)己酸效果最佳,并顯著富集到了3種碳鏈延長菌:12(16.04%±0.16%),(28.78%±0.15%),(2.32%±0.03%);將產(chǎn)己酸最優(yōu)的混合菌接種于餐廚垃圾進(jìn)行厭氧發(fā)酵,己酸濃度最高可達(dá)(8657.36±996.21)mg COD/L,己酸產(chǎn)率為(230.05±26.47)mg COD/gVS,己酸選擇度為27.74%±3.19%.以上結(jié)果驗(yàn)證了以乙醇和乳酸共同作為電子供體時(shí)對己酸菌具有明顯的富集作用,富集到的混合菌可有效用于餐廚垃圾的產(chǎn)己酸發(fā)酵,為餐廚垃圾的資源化利用提供了理論支撐.

電子供體；己酸；餐廚垃圾；厭氧發(fā)酵

己酸是含有6個碳原子的飽和中鏈脂肪酸,是重要的工業(yè)原料和能源物質(zhì)的前體物質(zhì)[1].在工業(yè)領(lǐng)域,己酸可用于生產(chǎn)動物飼料[2]、食品香料[3]、醫(yī)療藥物(如己酸孕酮)[4]等,是重要的生物基化學(xué)品.在能源領(lǐng)域,己酸可用于生產(chǎn)己烯和己烷等,用作汽車和飛機(jī)的燃料[5-6].目前,己酸的生產(chǎn)主要依賴于石油化工、天然動植物油脂提取,能耗大成本高[7].因此,探索一種經(jīng)濟(jì)環(huán)保的己酸生產(chǎn)方式擁有廣闊的前景和現(xiàn)實(shí)意義.

近年來,一種利用碳鏈延長技術(shù)將有機(jī)廢棄物轉(zhuǎn)化為己酸的方式越來越受到研究者的關(guān)注.碳鏈延長技術(shù)的化學(xué)基礎(chǔ)是逆β氧化反應(yīng),即通過特定的碳鏈延長微生物以特定的能源物質(zhì)作為電子供體,以短鏈脂肪酸作為電子受體,在生物酶的催化下,將短鏈脂肪酸延長為中鏈脂肪酸(6～12個碳原子)的技術(shù)[8-10].每進(jìn)行一次逆β氧化,短鏈脂肪酸會被增加兩個碳原子.目前,可作為碳鏈延長反應(yīng)的電子供體有很多,包括糖類、醇類、H2等,其中乙醇和乳酸是當(dāng)前研究中最為成熟的兩種電子供體,它們通過兩步氧化生成乙酰輔酶A,作為逆β氧化反應(yīng)中間體參與到碳鏈延長反應(yīng)中去[11].另外,有研究表明,當(dāng)乙醇和乳酸同時(shí)參與碳鏈延長反應(yīng)時(shí),可通過互相補(bǔ)充中間物、降低H2分壓、減少碳流失等方式來提高己酸產(chǎn)量[12].目前應(yīng)用于己酸生成的有機(jī)廢棄物有很多,主要包括釀酒廢水、乳清廢水、木質(zhì)纖維素、餐廚垃圾等[9].但是目前,大部分研究仍然依賴于外加電子供體來強(qiáng)化碳鏈延長反應(yīng)的效果[13].

餐廚垃圾是一種極具資源化價(jià)值的有機(jī)廢棄物,厭氧消化產(chǎn)甲烷是目前餐廚垃圾最主要的的資源回收方式[14-15].由于厭氧消化產(chǎn)甲烷技術(shù)存在體系穩(wěn)定性差、產(chǎn)氣率低、經(jīng)濟(jì)效益低等因素[16],越來越多的研究者致力于將餐廚垃圾通過碳鏈延長技術(shù)轉(zhuǎn)化為比甲烷具有更高附加值的己酸的研究[17-18].選擇合適的接種菌對于餐廚垃圾產(chǎn)己酸發(fā)酵具有關(guān)鍵作用,目前產(chǎn)己酸發(fā)酵的接種菌主要包括處理廢水的剩余污泥、窖泥、酒曲、酒糟等[19].然而,目前關(guān)于如何富集己酸菌研究鮮有報(bào)道.另外,現(xiàn)有餐廚垃圾產(chǎn)己酸的研究大多數(shù)依賴于電子供體的添加,如Roghair等[13]將餐廚垃圾水解酸化液作為底物,添加乙醇進(jìn)行碳鏈延長反應(yīng),獲得了5.5g/ (L×d)的己酸產(chǎn)率.而在不外加電子供體條件下直接將餐廚垃圾轉(zhuǎn)化為己酸的研究較為少見.

因此,本研究首先以批式發(fā)酵的方式,考察3種不同電子供體(乙醇、乳酸、乙醇和乳酸)對己酸菌的富集情況,并評估其產(chǎn)己酸性能;根據(jù)不同電子供體產(chǎn)己酸效能和微生物群落分析結(jié)果,以期獲得產(chǎn)己酸效果最優(yōu)的混合菌并用于后續(xù)餐廚垃圾的產(chǎn)己酸發(fā)酵,探究在不外加電子供體的情況下,餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)己酸的性能.本研究從接種菌源、不依賴電子供體、效能評估3個方面探究餐廚垃圾厭氧產(chǎn)己酸可能性,為餐廚垃圾新的資源化方式提供理論支撐.

1 材料與方法

1.1 材料

餐廚垃圾取自山東省濟(jì)南市某餐廚垃圾處理廠,主要組分為米飯、蔬菜、肉類、油脂等,經(jīng)過分揀、破碎、除油、稀釋等預(yù)處理后轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室4℃保存.接種污泥取自該餐廚垃圾處理廠內(nèi)長期用于厭氧消化產(chǎn)沼氣的厭氧消化罐,轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室4℃保存.實(shí)驗(yàn)過程中使用的配水為人工配置,其組份參考Leng等[20]的研究.餐廚垃圾和接種污泥的主要性質(zhì)見表1.

表1 餐廚垃圾和接種污泥主要性質(zhì)

1.2 實(shí)驗(yàn)方案和方法

1.2.1 己酸菌富集 采用批式發(fā)酵方式,共設(shè)置9個有效容積為500mL的厭氧瓶,每三個為一組平行,分別添加乙醇+乙酸、乳酸+乙酸、乙醇+乳酸+乙酸三種不同組合的底物,底物濃度參考Wu等[7]得出的最佳底物濃度的結(jié)果,并接種相同濃度的厭氧污泥,置于35℃的空氣搖床中振蕩(120r/min),運(yùn)行35d.在發(fā)酵過程中,當(dāng)?shù)孜锊蛔銜r(shí),及時(shí)補(bǔ)充.每隔3d取一次樣品,用于后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)物(揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)、乳酸和乙醇)的檢測,并調(diào)節(jié)pH值為5.5±0.1.其具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)置和底物濃度見表2.

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

1.2.2 微生物群落分析 選取1.2.1中第35d的9個樣品,對不同條件下富集的微生物群落進(jìn)行分析,結(jié)合理化檢測結(jié)果,篩選用于后續(xù)作為餐廚垃圾厭氧發(fā)酵的接種物.采用FastDNA?SPIN Kit for Soil試劑盒提取發(fā)酵樣品DNA, 利用16S rRNA基因片段的通用引物(338F/806R)對16S rRNA片段的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[20],通過上海美吉生物技術(shù)有限公司的Illumina MiSeq-PE250平臺進(jìn)行高通量測序.測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控、拼接、OTU聚類、數(shù)據(jù)庫比對,獲得每個樣品的微生物群落組成結(jié)果,結(jié)合理化檢測結(jié)果分析其相關(guān)性.其中,用于比對的數(shù)據(jù)庫為Silva數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de).

1.2.3 餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)己酸 選取1.2.1中產(chǎn)己酸效能最佳的一組厭氧混合菌作為接種物,用于餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)己酸.采用批式發(fā)酵的方式,設(shè)置3個有效容積為500mL的厭氧瓶,以餐廚垃圾為底物(213mL, 18.82g VS),取LA_ET中第35d的混合菌離心(8000r/min, 10min)和清洗,稱取6g,接種于餐廚垃圾,添加配水至500mL,置于35℃的空氣搖床中振蕩(120r/min),運(yùn)行30d.每隔3d取一次樣品(2mL),用于檢測發(fā)酵產(chǎn)物(VFAs、乳酸和乙醇)的濃度,并調(diào)節(jié)pH值于5.5±0.1.

1.3 常規(guī)指標(biāo)及檢測方法

總固體含量(TS)、揮發(fā)性固體含量(VS)、總化學(xué)需氧量(TCOD)、溶解性化學(xué)需氧量(SCOD)、pH值的檢測方法參照參照APHA[21].C、N等元素分析采用元素分析儀(SENSE EDX-1050)測定.7種揮發(fā)性脂肪酸(VFAs),包括乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸和正己酸,以及乙醇采用氣相色譜儀(GC,島津GC-2010)檢測,檢測條件為:DB-WAX色譜柱(30m×0.32mm×0.25mm),氫火焰檢測器(FID),以高純氮?dú)鉃檩d氣.乳酸采用高效液相色譜儀(HPLC,島津,LC-20A)檢測,檢測條件為:HSS T3色譜柱(4.6mm×150mm,5 μm),濃度為20mmol/L KH2PO4的流動相,流速為0.5mL/min,柱溫30℃.總蛋白質(zhì)和總脂肪含量分別采用凱氏定氮法和索氏提取法進(jìn)行測定[4-5],總碳水化合物采用苯酚-硫酸法測定[22].

1.4 數(shù)據(jù)處理

餐廚垃圾水解率(%)為發(fā)酵液中SCOD與最初投入餐廚垃圾的TCOD的比值;餐廚垃圾酸化率(%)為發(fā)酵液中累積的總揮發(fā)性脂肪酸(TVFAs)與發(fā)酵液中SCOD的比值,其中TVFAs濃度需要轉(zhuǎn)化為以COD作為計(jì)量單位[23].

式中的SCOD為發(fā)酵液中溶解性COD量;TCOD為試驗(yàn)啟動時(shí)投入的底物總COD量;TVFAs為發(fā)酵液種所有VFAs濃度的總和.

己酸產(chǎn)率(mg COD/gVS)為己酸產(chǎn)量(mg COD)與投入的餐廚垃圾VS(g)的比值.

式中:己酸為發(fā)酵液中己酸濃度(mg COD/L)

己酸選擇度(%)為發(fā)酵液中己酸所占的碳源與總VFAs的碳源的比值[24].

式中:己酸為發(fā)酵液中己酸的碳物質(zhì)的量濃度(mol/ L);θ為發(fā)酵液中所檢測到的VFAs(乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸、正己酸)的碳物質(zhì)的量濃度(mol/L);=8.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同電子供體條件下厭氧發(fā)酵產(chǎn)物分析

以不同電子供體作為底物厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物分布如表3所示.由結(jié)果可以看出,當(dāng)以乙醇作為單一的電子供體時(shí),僅在第10d檢測到了少量的己酸產(chǎn)生,濃度為(94.36±24.72)mg COD/L,此后25d沒有檢測到己酸.整個發(fā)酵過程中,正丁酸為主要的發(fā)酵產(chǎn)物,在第32d時(shí)最高濃度達(dá)到了(3107.83±1111.36)mg COD/L.另外,發(fā)酵液中剩余了大量未被利用的乙醇和乙酸.本次批式試驗(yàn)中,未檢測到丙酸和戊酸的產(chǎn)生.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,接種的厭氧混合菌沒有適應(yīng)以乙醇作為底物的碳鏈延長反應(yīng),只有少量的乙醇參與逆β氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為了丁酸.另外,乙酸含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,第15d降至最低,濃度為(1843.542±321.03)mg COD/L,隨后開始逐漸升高,第26d達(dá)到最高((3582.79±1042.58) mg COD/L),可推測,部分乙醇被氧化為乙酸,造成了乙酸的積累.該過程涉及的反應(yīng)見反應(yīng)式(5)～(7).反應(yīng)器中的丁酸沒有進(jìn)一步延長為己酸的原因與醇酸比、底物濃度等有直接關(guān)系,同時(shí)乙醇濃度過高對微生物會產(chǎn)生毒性[25].

CH3CH2OH+H2O→CH3COO-+H++2H2(5)

6CH3CH2OH+4CH3COO-→5CH3(CH2)2COO-+

H++2H2+4H2O(6)

6CH3CH2OH+5CH3(CH2)2COO-→CH3COO-+

5CH3(CH2)4COO-+H++2H2+4H2O (7)

CH3CHOHCOO-+H2O→CH3COO-+2H2+CO2(8)

CH3CHOHCOO-+CH3COO-+H+→CH3(CH2)2COO-+

H2O + CO2(9)

CH3CHOHCOO-+CH3(CH2)4COO-+H+→

CH3(CH2)4COO-+ H2O + CO2(10)

4H2+2CO2→CH3COO-+H++2H2O(11)

2H2+CH3COO-+H+→CH3CH2OH+H2O(12)

表3 不同電子供體條件下發(fā)酵產(chǎn)物濃度變化

注：“–”表示該實(shí)驗(yàn)組不涉及此項(xiàng)內(nèi)容.

當(dāng)以乳酸作為單一的電子供體時(shí),乳酸和乙酸消耗較快,第26d時(shí)乳酸濃度由最初的9630mg COD/L(100mM)降為0,乙酸濃度從3210mg COD/L (50mM)降至(1368.57±419.19)mg COD/L,為了實(shí)驗(yàn)的持續(xù)性,本實(shí)驗(yàn)組及時(shí)補(bǔ)充了乳酸和乙酸,濃度與實(shí)驗(yàn)初始濃度相同.從結(jié)果可以看出,正丁酸為主要發(fā)酵產(chǎn)物,最高濃度可達(dá)(9362.83±1083.13)mg COD/ L.整個發(fā)酵過程,僅在第10d、第26d、第29d檢測到了少量己酸的存在,其濃度分別為(66.94±14.29), (62.67±13.95),(45.92±97.41)mg COD/L.本實(shí)驗(yàn)中,絕大部分乳酸作為電子供體生成了正丁酸,己酸產(chǎn)量很少,說明在以乳酸作為單一的電子供體進(jìn)行碳鏈延長時(shí),反應(yīng)體系更傾向于產(chǎn)丁酸,而非己酸,這與部分研究結(jié)果比較一致[26-27].乳酸作為電子供體時(shí),經(jīng)兩步氧化先轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A,然后參與逆β氧化進(jìn)行碳鏈延長[28].當(dāng)乳酸逐漸被消耗,丁酸濃度趨于穩(wěn)定后,乳酸提供不了足夠的能量支持逆β氧化的進(jìn)行,乙酰輔酶A與乙酸生成丁酸后不再繼續(xù)碳鏈的延伸,造成了丁酸的積累.該過程涉及的反應(yīng)過程見反應(yīng)式(8)～(10).

當(dāng)以乙醇和乳酸同時(shí)作為電子供體時(shí),從第10d開始,檢測到少量己酸生成,濃度為(102.36± 16.85)mg COD/L,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,己酸含量逐漸增加,到第35d時(shí)己酸含量達(dá)到最高水平,濃度為(2303.06±499.56)mg COD/L.除了己酸,正丁酸也是主要的產(chǎn)物之一,最高濃度可達(dá)(5283.94±820.34)mg COD/L.其中,乳酸消耗較快,第26d時(shí)及時(shí)補(bǔ)充了乳酸.本研究結(jié)果表明,乙醇和乳酸同時(shí)作為電子供體時(shí)能夠顯著提高己酸的產(chǎn)量.已有研究報(bào)道,以乙醇作為電子供體的碳鏈延長微生物利用CO2為碳源合成細(xì)胞體,當(dāng)乳酸被氧化為丙酮酸時(shí)生成的CO2為碳鏈延長微生物提供了必要的碳源;另外,乙醇代謝產(chǎn)生的H2可以與CO2產(chǎn)生乙酸,進(jìn)而被還原為乙醇,參與碳鏈延長反應(yīng),乙醇和乳酸通過互相補(bǔ)充中間代謝物的方式提高了己酸的產(chǎn)量[29],該過程涉及的反應(yīng)見反應(yīng)式(5)～(12).

2.2 不同電子供體對己酸菌的富集結(jié)果分析

為了進(jìn)一步揭示不同電子供體對己酸菌的富集情況,本研究對2.1中三種不同條件下的微生物群落進(jìn)行分析.通過16S rRNA基因測序,共獲得1022059條優(yōu)化序列,利用OTU聚類分析(97%相似性)得到602個OTU.每組的多樣性指數(shù)如表4所示.Coverage指數(shù)代表了測序過程中文庫的覆蓋率[30],本次測序的覆蓋率均在99%以上,說明測序深度足夠反映樣品微生物群落的實(shí)際情況,測序結(jié)果可信.Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)代表樣品的微生物物種豐富度,Shannon指數(shù)和Simpson代表將微生物物種豐富度和均勻度考慮在內(nèi)的物種多樣性[31].從結(jié)果可以得知,當(dāng)乙醇作為電子供體(ET)時(shí)富集的微生物群落多樣性(OTU數(shù)量、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù))高于(<0.05)其他兩種實(shí)驗(yàn)組(LA和LA_ET),但從Simpsom指數(shù)和Shannon指數(shù)來看,三者之間的差異并不顯著,說明三種條件下富集到的微生物多樣性差異較大,但其物種均勻度不存在顯著差異.

表4 不同電子供體條件下微生物群落多樣性指數(shù)

由圖1(a)可見,9個樣品共檢測到了4種優(yōu)勢門類(31%),分別為厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、熱孢菌門(Thermotogae)、擬桿菌門(Bacteroidetes).其中LA組和LA_ET組具有相似的門類菌組成,Firmicutes含量最高,豐度分別為(69.13±12.78)%和(70.95±5.07)%,而ET組中Firmicutes含量為(19.62±5.08)%,說明單獨(dú)的乙醇作為電子供體厭氧發(fā)酵不利于Firmicutes的富集.根據(jù)已有研究報(bào)道,絕大多數(shù)的碳鏈延長微生物屬于Firmicutes,只有少數(shù)屬于Proteobacteria[8](本研究中未檢測出).因此,Firmicutes的相對豐度與發(fā)酵體系的產(chǎn)己酸性能有著緊密的關(guān)系.Actinobacteria是ET組中豐度最高(32.84%±1.12%)的門類菌,在LA (15.16%±11.16%)和LA_ET(13.73%±1.53%)中僅次于Firmicutes.根據(jù)報(bào)道,Actinobacteria是厭氧發(fā)酵體系中常被檢測到的水解酸化菌,它分泌的水解酶可以將大分子有機(jī)物分解為可溶性小分子物質(zhì)[32].一些研究表明,部分屬于Actinobacteria的微生物有助于四氫葉酸的產(chǎn)生,對己酸菌的生長有間接的促進(jìn)作用[33].另外兩種優(yōu)勢菌門Thermotogae和Bacteroidetes是常見的厭氧酸化菌,其中, Thermotogae可以將丁酸分解為乙酸和氫氣,Bacteroidetes可以將碳水化物和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸(丙酸和乙酸)等[34-35].

圖1(b)為屬水平上相對豐度高于1%的微生物在三種發(fā)酵體系中的富集結(jié)果.本研究共檢測到了10種優(yōu)勢屬,其中有3類屬于碳鏈延長菌:12,,,與己酸的產(chǎn)生有直接的關(guān)系.12和在很多研究中被報(bào)道能夠以乙醇作為電子供體進(jìn)行碳鏈延長反應(yīng),是較為常見的碳鏈延長微生物[29,36-38].是近年來發(fā)現(xiàn)的以乳酸作為電子供體的碳鏈延長菌[17],是本研究中發(fā)現(xiàn)的最主要的己酸菌.從結(jié)果可以看出,以乙醇和乳酸共同作為電子供體(LA_ET)時(shí),富集的己酸菌最多,包括12(16.04%±0.16%),(28.78%±0.15%),(2.32%±0.03%).以乳酸作為電子供體(LA)時(shí)富集的己酸菌以12(33.52%±0.28%)為主,但在本研究中添加的乳酸不足以驅(qū)動兩輪的碳鏈延長反應(yīng),最終產(chǎn)物以丁酸為主.在以乙醇作為電子供體(ET)時(shí),己酸菌豐度(5.94%±3.15%)非常少,主要以12(4.80%±2.78%)為主,因此,ET反應(yīng)器中己酸含量最少,只有少量正丁酸產(chǎn)生.另外,在ET中豐度最高的和是污泥中常被檢測到的水解酸化菌,對發(fā)酵前期底物的降解具有重要作用[39-41].

基于OTU物種的Anosim分析如圖1(c)所示,結(jié)果可以看出組間差異顯著高于組內(nèi)差異(<0.01),從統(tǒng)計(jì)學(xué)層面可以說明該分組是合理的,進(jìn)一步說明不同的電子供體富集的微生物物種具有顯著差異性.RDA(redundancy analysis)分析考察不同電子供體條件下微生物群落與理化性質(zhì)的相關(guān)性,如圖1(d)所示.結(jié)果顯示,和12是對反應(yīng)體系影響最大的兩個因子(箭頭越長,影響越大).主要在LA_ ET中富集,且與己酸正相關(guān)性最強(qiáng),可以說明LA_ ET中主要的己酸菌為.根據(jù)2.1結(jié)果得知,LA中的主要發(fā)酵產(chǎn)物為正丁酸,從RDA分析結(jié)果可以看出,與正丁酸相關(guān)性最強(qiáng)的菌屬為12,主要在LA中富集,說明12是最主要的產(chǎn)丁酸菌.對于ET分組,己酸菌富集較少,且在ET中富集的微生物與己酸相關(guān)性較弱甚至呈負(fù)相關(guān).因此,根據(jù)不同電子供體條件下厭氧發(fā)酵結(jié)果可以得出,當(dāng)以乙醇和乳酸共同作為電子供體(LA_ET)時(shí),對己酸菌具有明顯的富集作用.

圖1 不同電子供體條件下富集的微生物群落分析結(jié)果

(a)門水平優(yōu)勢菌(31%)在不同反應(yīng)體系中的分布;(b)屬水平優(yōu)勢菌(31%)在不同反應(yīng)體系中的富集結(jié)果;(c)基于OTU分類水平的不同條件下微生物群落差異性Anosim分析結(jié)果;(d)基于優(yōu)勢菌屬(31%)的RDA分析結(jié)果(虛線箭頭代表不同的理化性質(zhì),實(shí)線箭頭代表優(yōu)勢菌屬,不同形狀的圖形代表不同分組的樣品,圓形代表LA,三角形代表ET,正方形代表LA_ET)

2.3 富集的混合菌在餐廚垃圾厭氧發(fā)酵中的應(yīng)用

圖2(a)是將2.1中LA_ET中的混合菌接種于餐廚垃圾進(jìn)行厭氧發(fā)酵的結(jié)果.可以看出,發(fā)酵產(chǎn)物以正丁酸和己酸為主,其他VFAs產(chǎn)物含量較少.隨著發(fā)酵的進(jìn)行,己酸濃度逐漸增加,第27d時(shí)最高濃度可達(dá)(8657.36±996.21)mg COD/L.而正丁酸含量在第6d達(dá)到最高水平,濃度為(25874.05± 7757.83)mg COD/L,隨后逐漸下降,在第21d和第24d有略微上升.從第24d開始直到發(fā)酵結(jié)束,正丁酸濃度逐漸下降至(17070.83±192.02)mg COD/L,此過程伴隨著己酸濃度的上升,說明在發(fā)酵過程中部分正丁酸逐漸向己酸轉(zhuǎn)化.另外,在本研究中檢測到了乙醇和乳酸的產(chǎn)生.發(fā)酵第3d乙醇含量達(dá)到最高水平,濃度為(4168.84±636.13)mg COD/L,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,乙醇濃度逐漸下降,第21d時(shí)完全消失,推測乙醇在發(fā)酵過程中作為電子供體逐漸被碳鏈延長菌消耗.與乙醇相比,乳酸的產(chǎn)生量較少,一直低于100mg COD/L.圖2(b)為餐廚垃圾在發(fā)酵過程中的水解酸化結(jié)果,可以看出整個發(fā)酵過程水解酸化程度相對較為充分,從第3d開始水解率始終在80%以上,從第6d開始,酸化率在60%～90%范圍之間波動.研究結(jié)果可以看出,在不外加電子供體的情況下,以餐廚垃圾為底物進(jìn)行碳鏈延長反應(yīng)時(shí),雖然水解酸化較為充分,但卻未能提供充足的電子供體(乙醇和乳酸),絕大部分底物以生成丁酸為主要產(chǎn)物,沒有再進(jìn)一步生成己酸.很多研究表明,當(dāng)電子供體不足時(shí),反應(yīng)體系不能夠提供足夠的能量驅(qū)動碳鏈延長反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行,從而造成丁酸的積累[25,42-43].另外,正丁酸的存在同時(shí)意味著反應(yīng)體系具有較大的產(chǎn)己酸潛力,通過碳鏈延長反應(yīng)將積累的丁酸轉(zhuǎn)化為己酸為進(jìn)一步提高產(chǎn)己酸效率提供了一條新思路.目前,不外加電子供體情況下,將餐廚垃圾直接轉(zhuǎn)化為己酸的研究較少,單純依靠餐廚垃圾的水解酸化生成充足的電子供體和電子受體進(jìn)行碳鏈延長反應(yīng),仍然是餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)己酸面臨的挑戰(zhàn)[17-18,44].

圖2 餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)物濃度變化(a)和水解酸化程度(b)

圖3 餐廚垃圾厭氧發(fā)酵過程中己酸產(chǎn)率(a)和己酸選擇度(b)變化

由圖3可以看出,在發(fā)酵過程中,己酸產(chǎn)率逐漸升高,在第27d時(shí)最高可達(dá)(230.05±26.47)mg COD/g VS.Isaac等[45]以餐廚垃圾進(jìn)行以總VFAs為目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵時(shí),總VFAs產(chǎn)率為305mg COD/g VS,己酸所占的比例不足10%,低于本研究結(jié)果.當(dāng)反應(yīng)體系中VFAs過度積累,會對微生物的活性產(chǎn)生抑制作用,導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化率降低[45].在發(fā)酵過程中,總VFAs中己酸所占的碳源比例用選擇度來表示.從圖3(b)可以看出,己酸選擇度從第3d開始逐漸升高,最高達(dá)到27.74%±3.19%,且從第18d開始直到發(fā)酵結(jié)束,己酸選擇度在較小的范圍內(nèi)(21.34%～27.74%)波動,說明己酸的產(chǎn)生從第18d開始保持在一個比較穩(wěn)定的狀態(tài).Contreras-Davila等[17]利用餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)己酸時(shí),其己酸選擇度最高可達(dá)38%,高于本研究結(jié)果.己酸選擇度表明了己酸在發(fā)酵產(chǎn)物(VFAs)中碳源占比,反映了在底物水解酸化徹底后,碳鏈延長菌在反應(yīng)系統(tǒng)中的活躍度,當(dāng)碳鏈延長反應(yīng)足夠充分時(shí),會有更多的短鏈脂肪酸向己酸轉(zhuǎn)化,己酸選擇度變大;當(dāng)碳鏈延長反應(yīng)不夠充分時(shí),會導(dǎo)致短鏈脂肪酸的累積,己酸選擇度降低.

3 結(jié)論

3.1 當(dāng)乙醇和乳酸共同作為電子供體時(shí),產(chǎn)己酸效果最佳,對己酸菌具有明顯的富集作用;當(dāng)乙醇和乳酸分別作為單一電子供體時(shí),產(chǎn)物以正丁酸為主,不利于己酸菌富集.

3.2 乙醇和乳酸共同作為電子供體時(shí),可顯著富集三種己酸菌:(28.78%±0.15%),12(16.04%±0.16%),(2.32%±0.03%),其中,與己酸相關(guān)性最強(qiáng),是富集到的最主要的己酸菌.

3.3 經(jīng)己酸菌富集的污泥可在不外加電子供體的情況下,有效用于餐廚垃圾產(chǎn)己酸發(fā)酵,己酸濃度最高達(dá)到(8657.36±996.21)mg COD/L,己酸產(chǎn)率和選擇度可達(dá)(230.05±26.47)mg COD/g VS和(27.74± 3.19)%.

[1] De Groof V, Coma M, Arnot T, et al. Medium chain carboxylic acids from complex organic feedstocks by mixed culture fermentation [J]. Molecules, 2019,24(3),doi:10.3390/molecules24030398.

[2] Zentek J, Buchheit-Renko S, Ferrara F, et al. Nutritional and physiological role of medium-chain triglycerides and medium-chain fatty acids in piglets [J]. Animal Health Research Reviews, 2011, 12(1):83-93.

[3] Xu Y, Zhao J, Liu X, et al. Flavor mystery of Chinese traditional fermented baijiu: the great contribution of ester compounds [J]. Food Chemistry, 2021,369:doi:10.1016/j.foodchem.2021.130920.

[4] Jiang X, Tang F, Feng Y, et al. The adjustment of 17- hydroxyprogesterone cut-off values for congenital adrenal hyperplasia neonatal screening by GSP according to gestational age and age at sampling [J]. Journal of pediatric endocrinology & metabolism, 2019,32(11):1253-1258.

[5] Urban C, Xu J J, Strauber H, et al. Production of drop-in fuels from biomass at high selectivity by combined microbial and electrochemical conversion [J]. Energy & Environmental Science, 2017,10(10):2231- 2244.

[6] Harvey B G, Meylemans H A. 1-Hexene: a renewable C6platform for full-performance jet and diesel fuels [J]. Green Chemistry, 2014, 16(2):770-776.

[7] 吳清蓮.乙醇和乳酸引導(dǎo)的碳鏈增長技術(shù)生產(chǎn)中鏈羧酸的研究[D]. 哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2019.

Wu Q L. Study on medium chain carboxylic acid production from chain elongation technology induced by ethanol and lactate [D]. Harbin: Harbin Institute of Technology, 2019.

[8] Angenent L T, Richter H, Buckel W, et al. Chain elongation with reactor microbiomes: open-culture biotechnology to produce biochemicals [J]. Environmental Science & Technology, 2016,50(6): 2796-2810.

[9] Wu Q, Bao X, Guo W, et al. Medium chain carboxylic acids production from waste biomass: Current advances and perspectives [J]. Biotechnology Advances, 2019,37(5):599-615.

[10] Agler M T, Wrenn B A, Zinder S H, et al. Waste to bioproduct conversion with undefined mixed cultures: the carboxylate platform [J]. Trends in Biotechnology, 2011,29(2):70-78.

[11] Kumar A N, Omprakash S, Chandrasekhar K, et al. Upgrading the value of anaerobic fermentation via renewable chemicals production: A sustainable integration for circular bioeconomy [J]. Science of the Total Environment, 2022,806,doi:10.1016/j.scitotenv.2021.150312.

[12] Wu Q L, Guo W Q, Bao X, et al. Upgrading liquor-making wastewater into medium chain fatty acid: Insights into co-electron donors, key microflora, and energy harvest [J]. Water Research, 2018,145:650-659.

[13] Roghair M, Liu Y C, Strik D, et al. Development of an Effective Chain Elongation Process From Acidified Food Waste and Ethanol Into n-Caproate [J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2018, 6,doi:10.3389/fbioe.2018.00050.

[14] 王凱軍,王婧瑤,左劍惡,等.我國餐廚垃圾厭氧處理技術(shù)現(xiàn)狀分析及建議[J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2020,14(7):1735-1742.

Wang K J, Wang J Y, Zuo J E, et al. Analysis and suggestion ofcurrent food waste anaerobic digestion technology in China [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020,14(7):1735-1742.

[15] 張靖雪,李盼盼,于 洋,等.基于固液分離預(yù)處理的餐廚垃圾厭氧發(fā)酵 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2022,42(3):1252-1258.

Zhang J X, Li P P, Yu Y, et al. Study on anaerobic digestion of kitchen waste based on solid-liquid separation pretreatment [J]. China Environmental Science, 2022,42(3):1252-1258.

[16] 石 川,劉 越,馬金元,等.碳鏈延長技術(shù)在有機(jī)資源回收領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2020,40(10):4439-4448.

Shi C, Liu Y, Ma J Y, et al. Review on research progress of anaerobic microbial chain elongation in organic waste treatment [J]. China Environmental Science, 2020,40(10):4439-4448.

[17] Contreras-Davila C A, Carrion V J, Vonk V R, et al. Consecutive lactate formation and chain elongation to reduce exogenous chemicals input in repeated-batch food waste fermentation [J]. Water Research, 2020,169,doi:10.1016/j.watres.2019.115215.

[18] Nzeteu C O, Trego A C, Abram F, et al. Reproducible, high-yielding, biological caproate production from food waste using a single-phase anaerobic reactor system [J]. Biotechnology for Biofuels, 2018,11,doi: 10.1186/s13068-018-1101-4.

[19] 郭志超,徐先寶,徐婷婷,等.接種不同菌源的餐廚垃圾發(fā)酵代謝途徑及產(chǎn)己酸效能分析 [J]. 環(huán)境工程, 2021,39(9):160-168.

Guo Z C, Xu X B, Xu T T, et al. Analysis on fermentation pathway and caproate production from food waste by different inoculum [J]. Environmental Engineering, 2021,39(9):160-168.

[20] Leng L, Yang P X, Mao Y P, et al. Thermodynamic and physiological study of caproate and 1,3-propanediol co-production through glycerol fermentation and fatty acids chain elongation [J]. Water Research, 2017,114:200-209.

[21] Xiao J, Huang J, Huang M, et al. Application of basalt fiber in vertical flow constructed wetland for different pollution loads wastewater: Performance, substrate enzyme activity and microorganism community [J]. Bioresource Technology, 2020,318,doi:10.1016/ j.biortech.2020.124229.

[22] APHA, Standard methods for the examination of water and wastewater [S].

[23] 李蕓溪.餐廚垃圾資源化產(chǎn)短鏈/中鏈羧酸[D]. 哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2020.

Li Y X. Short chain/medium chain carboxylic acid was produced from food waste [D]. Harbin: Harbin Institute of Technology, 2020.

[24] Wu Q L, Guo W Q, Zheng H S, et al. Enhancement of volatile fatty acid production by co-fermentation of food waste and excess sludge without pH control: The mechanism and microbial community analyses [J]. Bioresource Technology, 2016,216,653-660.

[25] Zagrodnik R, Duber A, Lezyk M, et al. Enrichment versus bioaugmentation-microbiological production of caproate from mixed carbon sources by mixed bacterial culture and clostridium kluyveri [J]. Environmental Science & Technology, 2020,54(9):5864-5873.

[26] Liu Y, Lü F, Shao L, et al. Alcohol-to-acid ratio and substrate concentration affect product structure in chain elongation reactions initiated by unacclimatized inoculum [J]. Bioresource Technology, 2016,218:1140-1150.

[27] 王 冰.餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)中鏈脂肪酸的研究[D]. 哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2019.

Wang B. Study on medium chain fatty acids production from food waste anaerobic fermentation [D]. Harbin: Harbin Institute of Technology, 2019.

[28] Zhang Y Y, Pan X R, Zuo J, et al. Production of n-caproate using food waste through thermophilic fermentation without addition of external electron donors [J]. Bioresource Technology, 2022,343,doi:10.1016/ j.biortech.2021.126144.

[29] Zhu X Y, Tao Y, Liang C, et al. The synthesis of n-caproate from lactate: a new efficient process for medium-chain carboxylates production [J]. Scientific Reports, 2015,5:doi:10.1038/srep14360.

[30] Wu Q L, Guo W Q, Bao X, et al. Upgrading liquor-making wastewater into medium chain fatty acid: Insights into co-electron donors, key microflora, and energy harvest [J]. Water Research, 2018,145:650-659.

[31] Rodriguez-R L M, Konstantinidis K T. Estimating coverage in metagenomic data sets and why it matters [J]. Isme Journal, 2014, 8:2349-2351.

[32] Sinclair L, Osman O A, Bertilsson S, et al. Microbial community composition and diversity via 16S rRNA gene amplicons: evaluating the illumina platform [J]. PloS one,2015,10(2),doi:10.1371/journal. pone.0116955.

[33] Chen Y, Jiang X, Xiao K, et al. Enhanced volatile fatty acids (VFAs) production in a thermophilic fermenter with stepwise pH increase – Investigation on dissolved organic matter transformation and microbial community shift [J]. Water Research, 2017,112:261-268.

[34] Yu J, Huang Z, Wu P, et al. Performance and microbial characterization of two-stage caproate fermentation from fruit and vegetable waste via anaerobic microbial consortia [J]. Bioresource Technology, 2019,284:398-405.

[35] Lykidis A, Chen C L, Tringe S G, et al. Multiple syntrophic interactions in a terephthalate-degrading methanogenic consortium [J]. ISME Journal, 2011,5(1):122-130.

[36] Liu Y, Li X, Kang X, et al. Short chain fatty acids accumulation and microbial community succession during ultrasonic-pretreated sludge anaerobic fermentation process: Effect of alkaline adjustment [J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2014,94:128-133.

[37] Candry P, Huang S, Carvajal-Arroyo J M, et al. Enrichment and characterisation of ethanol chain elongating communities from natural and engineered environments [J]. Scientific Reports, 2020,10(1):doi: 10.1038/s41598-020-60052-z.

[38] Wu S L, Luo G, Sun J, et al. Medium chain fatty acids production from anaerobic fermentation of waste activated sludge [J]. Journal of Cleaner Production, 2021,279,doi:10.1016/j.jclepro.2020.123482.

[39] Fu X D, Ye R, Jin X, et al. Effect of nano zero-valent iron addition on caproate fermentation in carboxylate chain elongation system [J]. Science of the Total Environment, 2020,743,doi:10.1016/j.scitotenv. 2020.140664

[40] Rocha-Arriaga C, Espinal-Centeno A, Martinez-Sanchez S, et al. Deep microbial community profiling along the fermentation process of pulque, a biocultural resource of Mexico [J]. Microbiological Research, 2020,241,doi:10.1016/j.micres.2020.126593.

[41] 魯少文,魏翠翠,李澤華,等.新型己酸菌強(qiáng)化對人工窖泥培養(yǎng)過程中原核微生物群落結(jié)構(gòu)及酸、酯含量的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2020,26(1):144-151.

Lu S W, Wei C C, Li Z H, et al. Effects of a new caproic acid-producing bacteria on prokaryotic community structure and the content of acid and ester during the culture of artificial pit mud [J]. China Journal Applied Environmental Biology, 2020,26(1):144-151.

[42] Maus I, Koeck D E, Cibis K G, et al. Unraveling the microbiome of a thermophilic biogas plant by metagenome and metatranscriptome analysis complemented by characterization of bacterial and archaeal isolates [J]. Biotechnology for Biofuels, 2016,9,doi:10.1186/s13068- 016-0581-3.

[43] 余江南,劉春梅,黃振興,等.果蔬廢棄物兩相厭氧發(fā)酵產(chǎn)己酸的效能研究[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2020,39(1):232-240.

Yu J N, Liu C M, Huang Z X, et al. Two-phase caproate fermentation from fruit and vegetable waste [J]. Genomics and Applied Biology, 2020,39(1):232-240.

[44] Lonkar S, Fu Z H, Holtzapple M. Optimum alcohol concentration for chain elongation in mixed-culture fermentation of cellulosic substrate [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2016,113(12):2597-2604.

[45] Crognale S, Braguglia C M, Gallipoli A, et al. Direct conversion of food waste extract into caproate: Metagenomics assessment of chain elongation process [J]. Microorganisms, 2021,9(2):doi:10.3390/ microorganisms9020327.

[46] Owusu-Agyeman I, Plaza E, Cetecioglu Z. Production of volatile fatty acids through co-digestion of sewage sludge and external organic waste: Effect of substrate proportions and long-term operation [J]. Waste Management, 2020,112:30-39.

致謝：本論文的英文摘要部分由深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院王絲可博士和清華大學(xué)博士生Sanjena Naray anasamydamodaran協(xié)助修改完成,在此表示感謝.

Enrichment of caproate bacteria and its application in caproic acid production from food waste.

ZHANG Yan-yan1, BAI Jia-zhe2, ZUO Jian-e1,2*

(1.State Key Joint Laboratory of Environmental Simulation and Pollution Control, School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China；2.Tsinghua Shenzhen International Graduate School, Shenzhen 518055, China)., 2022,42(6)：2724～2733

This study investigated three different electron donor combinations to attain maximum enrichment of caproic acid bacteria and the ability of these enriched bacteria to further digest food waste without the addition of external electron donors. Three batch experiments were performed using ethanol, lactate, and ethanol plus lactate as electron donors. The results showed that the highest concentration of caproic acid ((2303.06±499.56) mg COD/L) was reached when ethanol and lactate were both used as electron donors which was justified by the significant increase in the microbial population of caproate bacterial genera such as12 (16.04%±0.16%),(28.78%±0.15%) and(2.32%±0.03%). When this enriched culture was inoculated to food waste, the maximum concentration of caproate reached (8657.36±996.21) mg COD/L, and the caproic acid yield and specificity were (230.05±26.47) mg COD/g VS and 27.74%±3.19% respectively. This study proved that caproic acid bacteria are significantly enriched in the presence of the electron donor combination of ethanol and lactate, and that the enriched inoculum can promote caproic acid production from food waste. These results provide theoretical support for the recovery of resources from food waste.

electron donors；caproic acid；food waste；anaerobic fermentation

X705

A

1000-6923(2022)06-2724-10

張艷艷(1991-),女,山東濰坊人,清華大學(xué)博士研究生,主要研究方向?yàn)椴蛷N垃圾厭氧發(fā)酵.發(fā)表論文1篇.

2021-12-01

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017ZX07103-007)

* 責(zé)任作者, 教授, jiane.zuo@mail.tsinghua.edu.cn