多黏菌素B發(fā)酵培養(yǎng)基研究

姜明星,隨子華,周 鑫

(華北制藥華勝公司,河北 石家莊 052160)

多黏菌素是由多黏芽孢桿菌產(chǎn)生的多種氨基酸和脂肪酸組成的環(huán)多肽類抗生素,對革蘭氏陰性細菌具有強烈的殺菌作用。其作用機制是多黏菌素與脂多糖在細菌外膜結合,改變膜結構,使小分子物質(zhì)泄漏從而抑制革蘭氏陰性菌的生長,其對銅綠假單胞菌和許多腸桿菌科有強大的抗菌活性[1]。多黏菌素B對大多數(shù)革蘭氏陰性菌有很強的抗菌作用,尤其是對綠膿桿菌效果更顯著,對大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、流感桿菌、百日咳桿菌、產(chǎn)氣桿菌和肺炎桿菌等也有很好的抗菌效果,對變形桿菌作用效果不明顯[2]。經(jīng)過論證:多黏菌素對生長繁殖期和靜止期的細菌都有效,屬窄譜抗生素[3]。臨床證明:多黏菌素B與桿菌肽聯(lián)合使用可以達到更好的治療效果,多黏菌素B對患者抵抗革蘭氏陰性菌有著十分重要的作用[4]。

多黏菌素B包含4個主要組分,分別是B1、B2、B3和B1-I。關于原料藥中的硫酸多黏菌素B的質(zhì)量要求,美國/歐洲藥典有明確規(guī)定[1]:多黏菌素B1、B2、B3和B1-I總質(zhì)量分數(shù)≥80%,最大單雜質(zhì)量分數(shù)≤3.0%,總雜質(zhì)量分數(shù)≤17%,B3質(zhì)量分數(shù)≤6.0%,B1-I質(zhì)量分數(shù)≤15%。世界上生產(chǎn)水平較高的阿爾法姆廠家,多黏菌素B的總質(zhì)量分數(shù)為87%～90%。國內(nèi)多家生產(chǎn)多黏菌素B的廠家多黏菌素B的總質(zhì)量分數(shù)雖然均在80%以上,但是最大單雜質(zhì)量分數(shù)極易超出藥典標準。

均勻設計是一種實驗點在實驗范圍內(nèi)充分分散的實驗設計方法[5],其思路是均勻分散實驗點,使每個實驗點有更好的代表性。筆者采用均勻設計法對多黏菌素B發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化,研究培養(yǎng)基中添加亮氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸對組分和雜質(zhì)的影響[6]。通過DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[7-8]進行數(shù)據(jù)的整理與分析,得出最優(yōu)氨基酸的添加方式,對減少產(chǎn)品最大單雜具有重大意義。該方法應用于規(guī)模化生產(chǎn),為企業(yè)在國內(nèi)外市場競爭中占據(jù)有利地位打下堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 出發(fā)菌株

多黏芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa),實驗室-80 ℃冰箱保藏。

1.1.2 培 養(yǎng) 基

斜面培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L,牛肉膏10 g/L,酵母浸粉5 g/L,瓊脂20 g/L,pH 6.8～7.0。

種子培養(yǎng)基:玉米淀粉80 g/L,葡萄糖10 g/L,酵母粉10 g/L,磷酸二氫鉀0.15 g/L,硫酸銨4.5 g/L,輕質(zhì)碳酸鈣4 g/L,消沫劑0.1 mL/L,pH 6.8～7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米淀粉100 g/L,酵母粉20 g/L,磷酸二氫鉀0.15 g/L,硫酸銨4.5 g/L,輕質(zhì)碳酸鈣0.4 g/L,消沫劑0.1 mL/L,pH 6.8～7.0。各種氨基酸首先按質(zhì)量濃度40 g/L配制成溶液備用,然后根據(jù)均勻設計結果按比例加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中[9]。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng):用無菌吸管從凍存管中吸取孢子液,接種0.2 mL到空白斜面培養(yǎng)基上,于29～31 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d。成熟的斜面種子于0～8 ℃保存,保存不超過30 d。

種子搖瓶培養(yǎng):選取培養(yǎng)好的斜面,用接種鏟鏟取適量斜面孢子接入種子培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速250 r/min,30 ℃培養(yǎng)27 h。

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng):搖瓶種子液培養(yǎng)好后,用無菌吸管按5%的體積分數(shù)接種量接入到發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速250 r/min,30 ℃培養(yǎng)40 h。

1.2.2 發(fā)酵液效價的檢測

發(fā)酵液的處理:首先取10 mL的發(fā)酵液,用純化水稀釋3～5倍,倒入離心管中,用離心機10 000 r/min離心10 min,取上清液,使用微孔濾膜過濾,然后使用HPLC檢測。

HPLC檢測條件:高效液相色譜儀為Agilent 1260;色譜柱采用C18硅膠柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動相為4.5 g無水硫酸鈉溶解到900 mL的水中,用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至2.3,用水稀釋至1 000 mL制成緩沖液;以V(乙腈)∶V(緩沖液)=20∶80為流動相進行分離;流速1.0 mL/min,紫外波長215 nm,進樣量20 μL,柱溫30 ℃,多黏菌素B1峰的保留時間為35～40 min,運行時間約60 min。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

多黏菌素B分子由亮氨酸(L-Leu)、苯丙氨酸(D-Phe)、蘇氨酸(L-Thr)、纈氨酸(D-Val)、絲氨酸(L-Ser)和異亮氨酸(L-Ile)6種氨基酸組成。取6種氨基酸分別以質(zhì)量濃度1 g/L的量加入到發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中,以不加入任何氨基酸的發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基作為對照,同時進行發(fā)酵培養(yǎng)[10],每組平行3個搖瓶實驗,取均值,測定發(fā)酵效價,以考察不同氨基酸對多黏菌素B發(fā)酵的影響,如圖1所示。

圖1 不同氨基酸對發(fā)酵效價的影響

由圖1可知:在對照培養(yǎng)基中分別加入6種氨基酸亮氨酸(L-Leu)、苯丙氨酸(D-Phe)、蘇氨酸(L-Thr)、纈氨酸(D-Val)、絲氨酸(L-Ser)和異亮氨酸(L-Ile)產(chǎn)生多黏菌素B效價大小順序為絲氨酸<蘇氨酸<纈氨酸<對照<異亮氨酸<苯丙氨酸<亮氨酸。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加蘇氨酸、纈氨酸和絲氨酸,發(fā)酵效價較對照降低,3種氨基酸的添加從不同程度上抑制菌絲的次級代謝,影響了多黏菌素B的合成。當發(fā)酵培養(yǎng)基中添加亮氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸時,發(fā)酵效價較對照穩(wěn)定或增長。3種氨基酸的添加從不同程度上提高了多黏菌素B的發(fā)酵效價,有利于菌絲的次級代謝。通過單因素實驗分析,確定了亮氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸3個因素對多黏菌素B發(fā)酵效價影響為正相關,對進一步研究培養(yǎng)基中添加氨基酸對多黏菌素B各組分及雜質(zhì)的影響具有指導意義[11]。

2.2 3種氨基酸添加量對多黏菌素B效價的影響

按照單因素實驗結果確定亮氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸對多黏菌素B發(fā)酵效價影響為正相關,進一步考察3種氨基酸的添加量對多黏菌素B發(fā)酵效價的影響。將可以明顯促進產(chǎn)物合成的亮氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸分別以質(zhì)量濃度0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 g/L加入到發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)實驗,每組平行3個搖瓶實驗,取均值,測定發(fā)酵效價,以考察不同氨基酸加量對多黏菌素B發(fā)酵的影響,如圖2所示。

圖2 不同氨基酸添加量對發(fā)酵效價的影響

由圖2可知:隨著亮氨酸添加量的增加,多黏菌素B發(fā)酵效價呈負相關,因此,發(fā)酵培養(yǎng)基中亮氨酸添加量不宜過大,確定亮氨酸合適的質(zhì)量濃度為0～1.2 g/L;隨著苯丙氨酸添加量的增加,多黏菌素B發(fā)酵效價呈負相關,因此,發(fā)酵培養(yǎng)基中苯丙氨酸添加量不宜過大,確定苯丙氨酸合適的質(zhì)量濃度為0～1.2 g/L;隨著異亮氨酸添加量的增加,多黏菌素B發(fā)酵效價呈正相關,因此,發(fā)酵培養(yǎng)基中異亮氨酸添加量可以適當增加,確定異亮氨酸合適的質(zhì)量濃度為1.0～4.0 g/L。確定了3種氨基酸的最適添加質(zhì)量濃度范圍,為進一步研究不同氨基酸組合對多黏菌素B組分和雜質(zhì)的影響奠定了基礎[12]。

2.3 均勻設計表

根據(jù)單因素實驗和不同氨基酸添加量的實驗結果分別確定3種氨基酸最適的質(zhì)量濃度范圍:亮氨酸(X1)0～1.2 g/L,苯丙氨酸(X2)0～1.2 g/L,異亮氨酸(X3)0～1.2 g/L。采用均勻設計進行3因素7水平的實驗設計[13],根據(jù)DPS數(shù)據(jù)處理軟件生成U7表格[14],如表1所示。

表1 均勻設計表U7(73)

均勻設計實驗雖然整齊性不如正交實驗,但均勻設計可以大大降低實驗次數(shù),節(jié)省人力物力,更快地得到實驗結果。DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可以進行數(shù)據(jù)處理和分析,建立數(shù)學模型,進行多元方差分析、回歸分析、多因素分析等多類多元分析。根據(jù)DPS數(shù)據(jù)處理軟件生成U7表格均勻性偏差CD=0.119 4,得到3因素7水平的實驗設計表,根據(jù)該設計表進行搖瓶實驗,每組實驗平行做3個搖瓶。

2.4 搖瓶實驗結果

以1.1.2發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎發(fā)酵配方,按照表1均勻設計結果添加不同比例的亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸。按照1.2.1進行搖瓶培養(yǎng),采用均勻設計法以減少實驗次數(shù),依據(jù)實驗方案進行發(fā)酵搖瓶實驗。搖瓶培養(yǎng)結束后,通過HPLC檢測得到發(fā)酵效價,按照質(zhì)量分數(shù)計算得出各組分及雜質(zhì)的效價,如表2所示。

表2 U7(73)搖瓶實驗結果

由表2數(shù)據(jù)可知:搖瓶培養(yǎng)基中添加不同比例的亮氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸,通過HPLC檢測有效成分B1、B2,主要雜質(zhì)B3、B1-I、B2后(未知雜質(zhì))和B1后(未知雜質(zhì))的效價均有很大不同。對實驗數(shù)據(jù)應用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進行二次多項式逐步回歸分析,獲得回歸方程進行數(shù)據(jù)分析。

2.5 數(shù)據(jù)分析與討論

對表2實驗結果采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行多元回歸分析[15-16],根據(jù)不同氨基酸組合與多黏菌素B各組分及雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)效價的關系,得到各組分及雜質(zhì)與氨基酸組合的回歸方程。

關于B2后雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的回歸方程為

Y=15.4+359.5X1+974.9X2-3 848.7X12-8 720.9X22+1 886.8X2X3

(1)

由式(1)可得3種氨基酸的添加比例與B2后雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的關系。當B2后雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)最小時,最優(yōu)添加比例為亮氨酸0 g/L、苯丙氨酸0 g/L、異亮氨酸2.6 g/L;最優(yōu)實驗得到最小B2后雜質(zhì)效價為15 U/mL,質(zhì)量分數(shù)為0.3%。

關于B1后雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的回歸方程為

Y=124.0+6 230.5X1-6 596.35X1X3

(2)

由式(2)可得:發(fā)酵培養(yǎng)基中添加亮氨酸會顯著影響B(tài)1后雜質(zhì)的質(zhì)量分數(shù),隨著亮氨酸添加比例的增加,B1后雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)顯著升高。不添加亮氨酸,B1后雜質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)則僅由原培養(yǎng)基決定。最優(yōu)實驗得到最小B1后雜質(zhì)效價為124 U/mL,質(zhì)量分數(shù)為1.7%。

關于B2組分質(zhì)量分數(shù)的回歸方程為

Y=1 802.0-26 669.7X1+119 153.7X12+164 149.9X1X2-21 976.1X2X3

(3)

由式(3)可得:發(fā)酵培養(yǎng)基中添加異亮氨酸會降低B2組分質(zhì)量分數(shù);隨著異亮氨酸添加比例的增加,B2組分質(zhì)量分數(shù)降低越明顯;苯丙氨酸具有與異亮氨酸同樣的效果。

關于B1組分質(zhì)量分數(shù)的回歸方程為

Y=2 710.2+17 809.4X12+17 421.7X32+125 196.6X1X2-53 970.7X1X3-43 688.8X2X3

(4)

由式(4)可得:3種氨基酸的添加比例對B1組分質(zhì)量分數(shù)的影響較為復雜,隨著亮氨酸添加比例的增加,B1組分質(zhì)量分數(shù)增加;異亮氨酸具有與亮氨酸同樣的效果;隨著苯丙氨酸添加比例的增加,B1組分質(zhì)量分數(shù)降低。

3 結 論

多黏菌素B是一種包含有效成分B1、B2以及多個雜質(zhì)B3、B1-I、B2后和B1后的多組分物質(zhì)。分析了多黏菌素B的結構式,選取6種氨基酸亮氨酸(L-Leu)、苯丙氨酸(D-Phe)、蘇氨酸(L-Thr)、纈氨酸(D-Val)、絲氨酸(L-Ser)和異亮氨酸(L-Ile)作為前體物質(zhì)分別加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。實驗發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加亮氨酸(L-Leu)、苯丙氨酸(D-Phe)和異亮氨酸(L-Ile)有利于發(fā)酵效價的提高。通過均勻設計實驗研究了發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的氨基酸都會影響多黏菌素B的組分和雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)。亮氨酸雖然能有限地降低B2后雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù),但會顯著增加B1后雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)。苯丙氨酸的增加會略微增加B2后雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù),對B1后雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)雖然基本無影響,但會顯著降低B1,B2的質(zhì)量分數(shù)。異亮氨酸質(zhì)量濃度的增加能降低B1后雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù),微量增加B2后雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù),并且隨著苯丙氨酸質(zhì)量濃度的增加會顯著增加B2后雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)。通過分析實驗數(shù)據(jù)可知發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氨基酸對多黏菌素B各組分及雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的調(diào)節(jié)具有重要意義,研究為企業(yè)規(guī)模化、工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐。