垂盆草水提工藝及產(chǎn)地優(yōu)選*

張 芹，錢 芳

（江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京210029）

垂盆草為景天科垂盆草Sedum SarmentosumBunge的干燥全草，有清熱解毒、利濕退黃功效，臨床用于治療濕熱黃疸、癰腫瘡瘍、小便不利等［1］，對藥物性肝損傷、脂肪性肝病、病毒性肝炎等肝病有獨特療效［2-3］。垂盆草含黃酮類、生物堿、三萜等化學(xué)成分［4-5］，黃酮類為其主要有效成分［6］，具有保肝［7］、抗纖維化［8］、抗氧化［9］、抗炎［10］、抗膽汁淤積［11］等作用。垂盆草分布較廣，所含化學(xué)成分受產(chǎn)地和采收季節(jié)影響較大［12-13］。臨床應(yīng)用垂盆草以湯劑為主。本研究中通過正交試驗法優(yōu)選垂盆草的水提工藝，同時測定不同產(chǎn)地垂盆草有效成分含量，為其藥材資源的優(yōu)選提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜儀（含G1322A 脫氣機、G1311A四元泵、G1316A柱溫箱、G1314A VWD 檢測器、Agilent ChemStation，美國Agilent 公司）；BP - 211D型電子分析天平（德國Sartorius公司，精度為0.01 mg）；Millipore-Q超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

木犀草苷對照品（批號為111720 - 201501，含量99.30%）、槲皮素對照品（批號為100081 - 201610，含量97.4%）、異鼠李素對照品（批號為110860-201611，含量99.0%），均購于中國食品藥品檢定研究院；垂盆草飲片（編號G1-G12）來源及批號見表1，由江蘇省中醫(yī)院朱育鳳主任中藥師鑒定為正品；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；水為超純水。

表1 垂盆草樣品來源及批號Tab.1 Source and batch numbers of Sedi Herba

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）- 0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～18 min時46%A，18～20 min時46%A→55%A，20～28 min時55%A，28～30 min 時55%A→46%A，30～35 min 時46%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

分別取木犀草苷對照品、槲皮素對照品和異鼠李素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL 含木犀草苷20.12 μg、槲皮素61.7 μg、異鼠李素98.4 μg的單一對照品溶液。分別取各單一對照品溶液適量，加甲醇稀釋，制成每1 mL 含木犀草苷6.287 5 μg、槲皮素36.634 μg、異鼠李素9.225 μg 的混合對照品溶液。精密吸取垂盆草樣品提取液（編號G1）1 mL，置具塞錐形瓶中，加甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）混合液25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.1.2項下混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，與對照品溶液相同位置處有相應(yīng)色譜峰，理論板數(shù)按木犀草苷、槲皮素和異鼠李素峰計均大于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

1.木犀草苷 2.槲皮素 3.異鼠李素A.混合對照品溶液 B.供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Luteolin-7-O-glucosid 2.Quercetin 3.IsorhamnetinA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.1.2項下混合對照品溶液3，5，10，20，30，40 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以各待測成分進樣量為橫坐標(biāo)（X，μg），峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程，木犀草苷為Y1=13.245X1+ 7.082 6（r= 0.999 9，n= 6），槲皮素為Y2=126.67X2+ 76.721（r= 0.999 9，n= 6），異鼠李素為Y3=27.355X3+15.208（r=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，木犀草苷、槲皮素、異鼠李素進樣量分別在0.018 9～0.251 5 μg、0.109 9～1.465 4 μg、0.027 7～0.369 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限考察：精密吸取混合對照品溶液適量，分別以信噪比（S/N）為1∶3 和1∶10 時的質(zhì)量濃度確定檢測限和定量限。結(jié)果木犀草苷、槲皮素、異鼠李素的檢測限分別為0.16，0.12，0.15 μg/mL，定量限分別為0.63，0.37，0.46 μg/mL。

精密度試驗：精密吸取2.1.2項下混合對照品溶液適量，按2.1.1 項下色譜條件，1 d 內(nèi)連續(xù)進樣測定6 次，連續(xù)進樣測定6 d，記錄峰面積。結(jié)果木犀草苷、槲皮素、異鼠李素日內(nèi)精密度的RSD分別為0.74%，0.58%，0.50%（n= 6），日間精密度的RSD分別為0.98%，1.01%，0.62%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液（編號G1），分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果木犀草苷、槲皮素、異鼠李素峰面積的RSD分別為1.33%，1.27%，1.05%（n=6）。表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密吸取樣品提取液（G1）適量，共6份，按2.1.2 項下制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果木犀草苷、槲皮素、異鼠李素峰面積的RSD分別為1.46%，1.19%，1.77%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取同一供試品溶液（編號G1），分別加入不同質(zhì)量濃度的木犀草苷、槲皮素、異鼠李素對照品溶液適量，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.2 正交試驗

2.2.1 試驗設(shè)計

以煎煮時間（因素A）、煎煮次數(shù)（因素B）、加水量（因素C）為考察因素，以木犀草苷、槲皮素、異鼠李素的總含量為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗法，優(yōu)選垂盆草水煎煮提取工藝。因素與水平見表3。

表3 因素與水平Tab.3 Factors and levels

2.2.2 試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5?？梢姡瑑H因素B 對結(jié)果有顯著影響，影響強度為B>A>C，最佳提取工藝為A2B3C1，即加8倍量水，煎煮3次，每次40 min。從節(jié)約能源和結(jié)合實際考慮，將煎煮次數(shù)減為2次。

表4 L9（34）正交試驗結(jié)果（n=9）Tab.4 Results of the L9（34）orthogonal test（n=9）

表5 方差分析結(jié)果Tab.5 Results of ANOVA

2.2.3 驗證試驗

取樣品（編號G1）50 g，精密稱定，共3 份，按上述優(yōu)選的工藝提取。結(jié)果木犀草苷、槲皮素、異鼠李素總含量的RSD小于1.10%，表明此水提工藝可行。詳見表6。

表6 驗證試驗結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.6 Results of the verification test（μg/g，n=3）

2.3 樣品含量測定

取12 批次樣品各適量，按優(yōu)選工藝提取，得提取液樣品，再按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項色譜條件進樣測定，記錄峰面積。并計算木犀草苷、槲皮素、異鼠李素總含量，平行測定3 次?？梢姡幪朑10，G11 提取液樣品中3 種成分總含量較大。詳見表7。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇

垂盆草含有黃酮類、三萜類等化學(xué)成分，槲皮素、木犀草苷、異鼠李素為黃酮類主要化學(xué)成分。木犀草苷有調(diào)節(jié)膽固醇水平、抗炎、抗病毒等作用［14］，槲皮素有抗炎、抗菌、抗癌等作用，以三者為指標(biāo)成分，可有效控制垂盆草藥材的質(zhì)量，以保證療效［15-16］。

3.2 洗脫條件選擇

本研究中參考2020 年版《中國藥典（一部）》［17］方法，在色譜條件中以甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55，V/V）為流動相等度洗脫，但發(fā)現(xiàn)色譜峰不能完全分離。改為梯度洗脫后色譜峰分離較好，故選擇梯度洗脫。

3.3 耐用性考察

預(yù)試驗中曾使用Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Amethyst C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Hedera C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）測定樣品含量，結(jié)果表明，色譜條件在一定范圍內(nèi)調(diào)整，含量均無明顯差異。

3.4 水煎煮工藝

垂盆草臨床應(yīng)用多為湯劑，根據(jù)藥材性質(zhì)以及為保持傳統(tǒng)湯劑的有效成分，多以煎煮制成［18］。其影響因素主要有浸泡時間、加水量、煎煮時間和煎煮次數(shù)等［19-20］，采用正交試驗法逐一優(yōu)化水提工藝［21］。1）浸泡時間，預(yù)試驗中考察了樣品浸泡0，30，60，90 min，發(fā)現(xiàn)浸泡與否對試驗結(jié)果無明顯影響，故正交試驗時選擇藥材不浸泡。2）加水倍數(shù)，考察了加6，8，10，12倍量水，發(fā)現(xiàn)加6倍量水時指標(biāo)成分含量略低，而根據(jù)方差分析結(jié)果來看，加水量對試驗結(jié)果無顯著影響，加8 倍量水含量最高，且更節(jié)約資源。因此，選擇加8 倍量水。3）煎煮時間，根據(jù)藥材性質(zhì)，選擇煎煮時間為30，40，60 min，結(jié)果表明煎煮時間對試驗結(jié)果無顯著影響，以煎煮40 min 時含量最高，故選擇煎煮40 min。4）煎煮次數(shù)，選擇煎煮次數(shù)為1，2，3次進行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由煎煮1次的效果明顯劣于2次或3次，而煎煮2次與3次時樣品含量差異較小。從節(jié)約能源和生產(chǎn)實際考慮，選擇煎煮2次。驗證試驗結(jié)果表明優(yōu)選的工藝合理、可行。

3.5 不同產(chǎn)地藥材樣品含量測定

中藥材的成分含量不同，會影響臨床藥效。不同產(chǎn)地垂盆草中木犀草苷、槲皮素、異鼠李素的含量存在較大差異，可能與產(chǎn)地的地理環(huán)境、雨水量、溫度及采收加工等因素有關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)，湖南（郴州、邵陽）產(chǎn)垂盆草樣品含量較高，可根據(jù)實際情況按需選擇。

綜上所述，本研究中優(yōu)選的水提工藝合理可行，可用于垂盆草的煎煮提取。湖南（郴州、邵陽）產(chǎn)垂盆草藥材中木犀草苷、槲皮素、異鼠李素總含量較高，可根據(jù)需要優(yōu)先選用。