球形棕囊藻對強額孔雀水蚤生長與繁殖的影響*

李 杰，陸家昌，王佳樂，賴俊翔，王英輝*

(1. 廣西大學(xué) 海洋學(xué)院 廣西 南寧 530004; 2. 廣西科學(xué)院 廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點實驗室 廣西北部灣海洋研究中心, 廣西 南寧 530007)

引 言

近年來，人類的活動加劇了近岸海域的富營養(yǎng)化程度，從而導(dǎo)致了近海赤潮發(fā)生的頻率逐年增加[1-4]。球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa) 隸屬于定鞭藻綱(Haptophyceae/prymnesiophyceae)，定鞭藻目(Prymnesiales)，是一種廣溫廣鹽性的的藻類，廣泛分布于熱帶、亞熱帶以及溫帶海域[5-7]。自上個世紀(jì)90年代末以來，球形棕囊藻赤潮開始在中國近岸海域開始頻繁地爆發(fā)，而且赤潮持續(xù)的時間較長，對漁業(yè)，旅游以及海岸帶生態(tài)環(huán)境等造成極大的影響[8-12]，引發(fā)的危害不容忽視，與此同時，球形棕囊藻赤潮所關(guān)聯(lián)的生態(tài)效應(yīng)也引起社會各方廣泛地關(guān)注。

浮游橈足類是海洋浮游植物的重要攝食者, 在海洋初級生產(chǎn)力向高級營養(yǎng)級轉(zhuǎn)化的過程中可以作為轉(zhuǎn)遞物質(zhì)和能量的載體, 是海洋食物網(wǎng)中重要的角色[13-14]。在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，橈足類的攝食作用可以直接影響到浮游植物的種類、生長、數(shù)量和赤潮的發(fā)生[15]。橈足類會受到赤潮的影響，赤潮可能會改變其行為方式, 存活以及繁殖能力[16-17]。在海洋食物鏈中，如果橈足類的豐度因為赤潮受到影響, 那么橈足類的消費者們也有可能受到影響, 因此赤潮對橈足類的影響與近岸海域生態(tài)系統(tǒng)的平衡有重要的聯(lián)系。強額孔雀水蚤(Parvocalanuscrassirostris) 是熱帶、亞熱帶以及溫帶海域廣泛分布的橈足類, 分布區(qū)域從北部的渤海延伸至南海的北部灣海域[18-21]。強額孔雀水蚤具有適口性好、營養(yǎng)齊全和繁殖周期短的特點，這意味著，強額孔雀水蚤可以為幼魚提供滿足生長與發(fā)育所必需的能量與物質(zhì)[22-23]。因此，強額孔雀水蚤在中國近岸食物網(wǎng)中扮演著重要的角色。目前對橈足類攝食棕囊藻的研究已經(jīng)有許多報道[24]。其中，有研究指出柱形寬水蚤(TemoraStylifera)以球形棕囊藻為食會影響產(chǎn)卵量而不影響存活[25]。也有研究指出，攝食球形棕囊藻會影響長角寬水蚤(Temoralongicornis)無節(jié)幼體的正常生長發(fā)育[26]。此類研究都發(fā)現(xiàn)了球形棕囊藻會對橈足類產(chǎn)生消極影響的現(xiàn)象，但是，關(guān)于強額孔雀水蚤攝食棕囊藻的研究缺乏報道，有待開展研究。

根據(jù)捕食者-被捕食者之間的粒級關(guān)系, 雖然強額孔雀水蚤不能夠有效地攝食囊體直徑較大的(>30 μm)球形棕囊藻，但是從球形棕囊藻囊體釋放出來的游離細(xì)胞和直徑較小(<30 μm)的囊體是可以被強額孔雀水蚤攝食的[24,27]。球形棕囊藻具有兩種不同的生活史：游離單細(xì)胞態(tài)和囊體態(tài)，球形棕囊藻赤潮一般以囊體態(tài)爆發(fā)，囊體態(tài)的球形棕囊藻超過80%是二倍體細(xì)胞[28]?；趶婎~孔雀水蚤在近岸海域的重要角色以及球形棕囊藻赤潮的發(fā)生可能對其產(chǎn)生潛在的負(fù)面影響，利用球形棕囊棕二倍體單細(xì)胞與強額孔雀水蚤開展實驗，探討球形棕囊藻赤潮對強額孔雀水蚤的影響是有必要的。

本研究以球形棕囊藻作為食物投喂強額孔雀水蚤，測定強額孔雀水蚤的死亡率、產(chǎn)卵量及其脂肪酸組分，并利用3種常見的微藻：球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)和威氏海鏈藻(Thalassiosiraweissflogii)作為對比食物。探討攝食球形棕囊藻對強額孔雀水蚤生長和繁殖的影響，以期揭示發(fā)生球形棕囊藻赤潮對橈足類強額孔雀水蚤存在的危害，為評價和預(yù)測球形棕囊藻赤潮對熱帶以及亞熱帶近岸海域生態(tài)系統(tǒng)造成的影響提供可靠科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微藻的來源

實驗所使用的球形棕囊藻、球等鞭金藻、威氏海鏈藻和牟氏角毛藻均由北部灣海洋微藻資源庫提供。藻類培養(yǎng)用f/2培養(yǎng)液[29]，置于恒溫培養(yǎng)室中，溫度為20±1°C，鹽度為30±1，光照強2000 Lux，光暗比為12 h:12 h。

1.2 橈足類培養(yǎng)

強額孔雀水蚤于2018年9月份采集自北部灣近岸海域的欽州灣，利用淺水II型浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)長: 140 cm，網(wǎng)口面積: 784.27 cm2，網(wǎng)的孔徑: 0.160 mm)由底層向上垂直拖網(wǎng)，采集到的浮游動物暫養(yǎng)于20 L的塑料桶中，迅速轉(zhuǎn)移到實驗室。將活力較強的強額孔雀水蚤成體(體長在0.4～0.6 mm之間)從浮游動物樣品中分離出來，放在5 L的塑料瓶中單獨培養(yǎng)，溫度為20±1°C，海水鹽度為30±1，光暗比為12 h:12 h，投喂的餌料為球等鞭金藻，每兩天投喂一次，食物量的碳含量濃度大概維持在1000 μg C/L。每個星期換水以除去瓶子底部的糞便顆粒以及食物殘渣，保證水質(zhì)環(huán)境優(yōu)良。

在實驗開始前將強額孔雀水蚤分別轉(zhuǎn)移到不同餌料食物的培養(yǎng)組中，投喂相同的食物量，為了消除實驗前的餌料食物產(chǎn)生的影響，此過程持續(xù)的時間為強額孔雀水蚤的一個世代周期(30 d)[24]。球形棕囊藻單細(xì)胞是由含有囊體的球形棕囊藻培養(yǎng)液經(jīng)10 μm篩網(wǎng)在自然重力的條件下過濾連續(xù)兩次獲得，此操作是為了去除囊體結(jié)構(gòu)，以獲得球形棕囊藻的2倍體單細(xì)胞[28]。通過流式細(xì)胞儀進行驗證所獲得的球形棕囊藻單細(xì)胞為2倍體細(xì)胞。其余食物組的微藻餌料則是直接投喂，作為餌料食物所用的藻類都處于指數(shù)生長階段。各食物實驗組的餌料細(xì)節(jié)信息見表1。餌料微藻的細(xì)胞碳含量計算方法參照Reynolds的文獻中的葉綠素與碳含量之間的比值[30]。強額孔雀水蚤的食物碳含量維持在1000 μg C/L。

表1 強額孔雀水蚤的微藻食物

1.3 強額孔雀水蚤雌體的產(chǎn)卵量以及強額孔雀水蚤無節(jié)幼體和橈足幼體的存活率

從各個餌料食物培養(yǎng)組的瓶子里隨機挑選出強額孔雀水蚤5對雌雄個體，每兩天投喂一次，食物量的碳含量濃度大概維持在1000 μg C/L。每隔8 h通過尼康倒置顯微鏡檢查每隔培養(yǎng)皿底部的卵，記錄每個組的累計產(chǎn)卵量。把卵收集起來放到新的培養(yǎng)皿，再投以相同的餌料以及相同的食物量。孵化后的無節(jié)幼體重新分離到新的培養(yǎng)皿，每天記錄存活的個數(shù)，當(dāng)有個體生長發(fā)育到達橈足幼體階段再把它轉(zhuǎn)移到一個新的培養(yǎng)皿，同樣記錄每天的存活率，具體的實驗操作參照Alajmi 等的方法[23]。實驗過程中，每兩天更換一次容器內(nèi)的海水以除去食物殘渣和糞便顆粒，并加入新的藻液作為食物。

橈足類的死亡率的計算方法如下：

1.4 脂肪酸含量分析

從不同餌料食物組的瓶子里收集強額孔雀水蚤成體進行48 h的冷凍干燥，還有處于指數(shù)生長期的各種微藻食物也通過離心收集后冷凍干燥48 h。對所得樣品進行脂肪酸甲酯化得到脂肪酸甲酯，具體的操作方法主要參照Morrison等人的實驗[31]。脂肪酸甲酯的定量：利用安捷倫7890A-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀組分進行分析，進樣口溫度為250°C，升溫程序為：100°C升溫至250°C，保持11 min，升溫速率為10°C/min。色譜柱為HP-INNWWax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。內(nèi)標(biāo)采用正十九烷酸甲酯。脂肪酸的定性：利用保留時間與實驗室獲得的已知的數(shù)據(jù)進行比較，確定相對各個脂肪酸組分。脂肪酸的定量：通過比對內(nèi)標(biāo)正十九酸甲酯(methyl nonadecanoate, C19:0)的波峰面積確定各個組分的脂肪酸含量。以各個脂肪酸占總脂肪酸含量的百分比表示。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)的方式表示，組間的數(shù)據(jù)單因素方差分析利用(one-way ANOVA，P<0.05)進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)處理的軟件利用SPSS 20.0。其中，存活率在進行方差分析前對數(shù)據(jù)采取正反弦數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果分析

2.1 死亡率

不同食物組間的強額孔雀水蚤無節(jié)幼體階段的死亡率存在差異(圖1 A)，以球形棕囊藻食物組的死亡率最高，為65.93±4.18%。不同食物組下的強額孔雀水蚤的橈足幼體的死亡率表現(xiàn)出顯著性的差異(P<0.05)，其中，球形棕囊藻食物組的死亡率顯著高于其他的食物組，達到了69.74±6.50% (圖1 B)?？傮w而言，由累積死亡率可以看出，強額孔雀水蚤的無節(jié)幼體階段和橈足幼體階段的最高死亡率都是出現(xiàn)在球形棕囊藻食物組，死亡率累積值達到了80.11±3.97%，顯著高于其它的食物培養(yǎng)組(圖1 C;P<0.05)。

圖1 強額孔雀水蚤的死亡率

2.2 產(chǎn)卵量

由實驗結(jié)果 (圖2) 可知，以球形棕囊藻細(xì)胞培養(yǎng)的強額孔雀水蚤雌體的產(chǎn)卵量顯著少于其它各個食物組(P<0.05)，平均的每日產(chǎn)卵量只有 1.28±0.79個。其次是以威氏海鏈藻培養(yǎng)的強額孔雀水蚤的雌體的產(chǎn)卵量，日平均產(chǎn)卵量有 3.14±1.87個，明顯高于球形棕囊藻食物組的平均日產(chǎn)卵量(P<0.05)；而牟氏角毛藻食物組的日產(chǎn)卵量平均值為 7.70±3.53個，明顯高于球形棕囊藻食物組的平均每日產(chǎn)卵量(P<0.001)；日平均產(chǎn)卵量最多的是球等鞭金藻食物組的強額孔雀水蚤雌體，為 10.34±5.83個，顯著高于球形棕囊藻食物組的平均日產(chǎn)卵量(P<0.05)。

圖2 強額孔雀水蚤的雌體階段的日平均產(chǎn)卵量

2.3 脂肪酸分析

以牟氏角毛藻、威氏海鏈藻、球形棕囊藻和球等鞭金藻為食物培養(yǎng)的強額孔雀水蚤的脂肪酸成分分析結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?，球形棕囊藻食物組的強額孔雀水蚤的總脂肪酸含量最低只有9.04mg/g，各個食物組的強額孔雀水蚤的總脂肪酸(TFA)含量高低的排列順序為：Iso > TW > Cht > PG；單不飽和脂肪酸 (MUFA)含量高低的排序為：TW > Iso > Cht > PG；而多不飽和脂肪酸(PUFA)的含量高低排序與單不飽和脂肪酸的高低排序相同為：TW > Iso > Cht > PG。脂肪酸的分析結(jié)果還表明，以球形棕囊藻培養(yǎng)的強額孔雀水蚤的脂肪酸成分主要是：C14，C16，C16:1ω9，C18，這幾種脂肪酸占到總脂肪酸總含量的75.43%。另外，其ω3系列和ω6系列脂肪酸含量分別只有2.81%和9.38%。特別值得指出的是，以球形棕囊藻培養(yǎng)的強額孔雀水蚤的脂肪酸成分并沒有檢出C20:5ω3(EPA, 二十碳五烯酸)，且C22:6ω3(DHA, 二十二碳六烯酸)的含量僅為 2.81%。從整體上看，PUFA僅占有總脂肪酸的12.19%，最多的是飽和脂肪酸(SAFA)，占有61.53%，其次就是MUFA，占有26.28%，如(圖3B)所示。

表2 不同食物喂養(yǎng)的強額孔雀水蚤的脂肪酸組成成分

通過測定微藻食物的脂肪酸組成成分相對含量發(fā)現(xiàn)，球形棕囊藻(如表3所示)并沒有檢測出C20:5ω3(EPA, 二十碳五烯酸)和C22:6ω3(DHA, 二十二碳六烯酸)，而且PUFA含量只有5.6%。與其他的三種微藻食物的脂肪酸組分對比可以看出，球形棕囊藻的總脂肪酸含量最低，為(11.69 mg g-1dw)，其中，PUFA占比最低，為5.6%，主要以SAFA為主，占有比例超過了50%(如圖3A)。在四種微藻食物中，球等鞭金藻的總脂肪酸含量最高，為(101.17 mg g-1dw)，其中，PUFA的占比達到了49.01%。

表3 微藻食物的脂肪酸組成成分

圖3 微藻食物(A)和橈足類強額孔雀水蚤(B)的脂肪酸種類組成

3 討論

PUFA是橈足類自身無法直接合成卻又屬于生長與繁殖所必需的物質(zhì)，例如ω3系列和ω6系列的脂肪酸[32]，特別是EPA和DHA，與橈足類的存活率和產(chǎn)卵量有直接聯(lián)系[33-35]。在本實驗中，球形棕囊藻食物組的強額孔雀水蚤的死亡率要高于其它食物組。而且，球形棕囊藻食物組的強額孔雀水蚤的產(chǎn)卵量低于其它食物組。Verity與Smayda的研究發(fā)現(xiàn)，湯氏紡錘水蚤(Acartiatonsa)和哈德遜紡錘水蚤(Acartiahudsonica)攝食波切棕囊藻會導(dǎo)致其產(chǎn)卵量的下降[36]。 此外，Tang等人的研究發(fā)現(xiàn)，攝食球形棕囊藻不僅會導(dǎo)致湯氏紡錘水蚤(A.tonsa)的產(chǎn)卵下降，還阻礙了無節(jié)幼蟲的正常發(fā)育[37]，本研究的結(jié)果與前人的研究相似。由微藻食物的脂肪分析結(jié)果表明，球形棕囊藻的脂肪酸成分中PUFA的含量較少，尤其是缺少EPA和DHA(表3)。一般來說，食物的PUFA含量低意味著食物的營養(yǎng)價值也低[38]，Claustre 等人的實驗結(jié)果指出了球形棕囊藻是一個PUFA含量低的食物，而橈足類需要盡可能多地攝食球形棕囊藻才能滿足自身的新陳代謝和繁殖所需[37,39-40]。同時，球等鞭金藻是強額孔雀水蚤的優(yōu)質(zhì)食物[23]，其脂肪酸組分中PUFA的含量較多，達到了49.01%(表3)。球等鞭金藻食物組的強額孔雀水蚤的產(chǎn)卵量顯著高于球形棕囊藻食物組(p<0.05)，且死亡率顯著低于球形棕囊藻食物組(P<0.05)。這表明，強額孔雀水蚤的高死亡率以及低產(chǎn)卵量與球形棕囊藻的低營養(yǎng)價值有關(guān)系。

在球形棕囊藻的脂肪酸成分中，C14:0， C16:0和 C18:0占到總脂肪酸含量的51.73%。在所有脂肪酸種類中，C18:1ω9的含量最高，占比達到25.47%(表3)。類似地，已有研究表明，C14:0， C16:0和 C18:0是棕囊藻的特征脂肪酸[39,41]，在愛爾蘭海(The Irish Sea)的棕囊藻赤潮中也檢測出有較高含量的C18:1ω9[39]。這與本研究所檢測出的球形棕囊藻的脂肪酸組分相符合。脂肪酸是一種較為穩(wěn)定的生物標(biāo)記物，經(jīng)生物消化吸收后其結(jié)構(gòu)可以基本保持不變，可以用于辨別生物餌料的來源[33]。通過檢測橈足類強額孔雀水蚤的脂肪酸組分發(fā)現(xiàn)，球形棕囊藻食物組的強額孔雀水蚤的脂肪酸組分與球形棕囊藻的脂肪酸組分相似(圖3)，以SAFA為主要的成分，PUFA占比較少。需要注意的是，ARA(C20:4ω6)是強額孔雀水蚤的脂肪酸中占比最多的PUFA(表2)。對于ω6系列的長鏈不飽和脂肪酸，甲殼動物一般無法自身合成，需要從攝食的食物種獲取[42]。而這與球形棕囊藻所含有的脂肪酸組分特征相對應(yīng)(表3)，在球形棕囊藻的脂肪酸組分中，ARA是其含量最高的PUFA種類?？梢酝茰y，強額孔雀水蚤的脂肪酸含量低是由于攝食球形棕囊藻造成的。

4 結(jié)論

攝食球形棕囊藻造成了強額孔雀水蚤無節(jié)幼體和橈足幼體的存活率下降，成年雌體的產(chǎn)卵量下降，成體體內(nèi)的PUFA含量變低?？梢酝茰y，當(dāng)球形棕囊藻赤潮爆發(fā)的時候，單一的浮游植物種群大范圍地占據(jù)了優(yōu)勢地位，強額孔雀水蚤可能會因為攝食了球形棕囊藻而使得種群的繁殖與增長受阻，個體的營養(yǎng)質(zhì)量也會因此下降。因此，發(fā)生球形棕囊藻赤潮會可能會對強額孔雀水蚤以及以強額孔雀水蚤為食的其他海洋生物造成負(fù)面的影響。研究結(jié)果可以為全面評估近海的球形棕囊藻赤潮對橈足類結(jié)構(gòu)群落產(chǎn)生的影響提供科學(xué)的參考資料。