灰皮支黑豆GmPUB24基因的生物信息學(xué)與胞囊線蟲誘導(dǎo)表達(dá)分析

李文辰，劉 鑫，齊澤錚，于 璐，王 芳

(齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

大豆胞囊線蟲(，soybean cyst nematode，SCN)引起的大豆胞囊線蟲病是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一，在中國每年造成近120億的損失。培育和種植抗病品種是防治該病害的主要措施?？剐赃z傳分析鑒定到SCN抗性主要的數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus，QTL)有1、2、3、4、5。近期研究發(fā)現(xiàn)，位于18號染色體的1和位于8號染色體的4對SCN抗性機(jī)制不同。在1上發(fā)現(xiàn)2個等位基因起決定性作用，分別為1-與1-，1-介導(dǎo)的線蟲抗性是由位點(diǎn)多個基因的拷貝數(shù)決定?；趫D位克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)，4位點(diǎn)的基因合成絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(serine hydroxymethyltransferase，SHMT)，影響葉酸代謝途徑進(jìn)而影響SCN取食位點(diǎn)的建立或維持。

植物對病原物的免疫能力包括兩層，一是由細(xì)胞表面模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別病原微生物關(guān)聯(lián)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)引發(fā)的免疫反應(yīng)(PAMP-triggered immunity，PTI)，第二層是富含亮氨酸的受體識別病原物效應(yīng)子，觸發(fā)ETI(effector-triggered-immunity)反應(yīng)。植物泛素-蛋白酶系統(tǒng)(ubiquitin-26S proteasome system，UPS)是真核生物細(xì)胞中一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，該系統(tǒng)包含泛素(ubiquitin)、E1泛素活化酶、E2泛素結(jié)合酶、E3泛素連接酶。E3泛素連接酶是UPS系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)E2泛素中間體到底物蛋白過程中重要的連接酶，根據(jù)蛋白酶結(jié)構(gòu)的差異可分為單亞基與多亞基兩類，單亞基包含HECT、Ring、U-box三大家族，多亞基有CRLs等復(fù)合體家族。已有不少研究表明，植物U-box家族基因與植物抗病能力有密切聯(lián)系。擬南芥17基因通過分泌相關(guān)蛋白介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡(PCD)從而激活PAMP并觸發(fā)PTI，提高對疫霉菌的抗性。擬南芥22、23和24基因的三聯(lián)突變體負(fù)調(diào)節(jié)PTI反應(yīng)并提高病原菌侵染抗性。番茄13基因與4蛋白互作，提高番茄對番茄葉斑病(pv.DC3000)的抗性。受侵染的馬鈴薯基因表達(dá)量增加，沉默基因，植株根部腐爛的程度明顯提高，表明基因表達(dá)會提高馬鈴薯的抗病性。外源激素例如茉莉酸(jasmonic acid，JA)、水楊酸(salicylic acid，SA)、乙烯(ethyne，ETH)途徑也調(diào)節(jié)大豆對SCN的抗病性，外源SA會誘導(dǎo)大豆6與8基因表達(dá)，使根部胞囊線蟲減少，提高大豆對胞囊線蟲的抗性。

Zhang等對大豆泛素化體系編碼基因的全基因組研究發(fā)現(xiàn)，大量E3泛素連接酶基因被SCN誘導(dǎo)表達(dá)，其中含有大量編碼U-box結(jié)構(gòu)域的基因。本課題組對大豆胞囊線蟲侵染的灰皮支黑豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)了多個編碼U-box家族蛋白結(jié)構(gòu)域的基因，其表達(dá)水平受胞囊線蟲侵染影響。本研究以抗病品種(灰皮支黑豆)為材料，克隆24基因并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為U-box家族基因在抗胞囊線蟲病中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用大豆品種為抗大豆胞囊線蟲品種灰皮支黑豆(，ZDD2315)。克隆載體pGEM-T easy購自美國Promega Corporation，大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 大豆幼苗培養(yǎng)與SCN的接種

將灰皮支黑豆種子使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%次氯酸鈉浸泡2 min，再用無菌水沖洗15 min，將種子放置在PVC管中，內(nèi)部加入無菌土，于20～24 ℃黑暗條件下培養(yǎng)至出苗，待幼苗生長至第一片復(fù)葉完全展開進(jìn)行接種。將大豆感病品種(遼豆15號)繁殖的胞囊經(jīng)20目、80目篩孔清水沖洗，用蔗糖漂浮法收集，用無菌水沖洗掉胞囊上的蔗糖，用膠塞碾碎胞囊并用3 mol·LZnSO孵育，孵育4 d后使用500目篩孔收集卵，懸浮于無菌水中，使用磁力攪拌器以100 g混勻，吸取10 μL在顯微鏡下計(jì)數(shù)，將卵懸浮液調(diào)整為1 mL含2 000粒卵。每株大豆根部接種1 mL卵懸液。共接種20株，分別在接種后1、2、3、5、7、10 d取樣，每個時間點(diǎn)取4株苗作為4個重復(fù)，用于實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測。

1.3 大豆根部RNA提取與cDNA合成

取接種胞囊線蟲的灰皮支黑豆根尖100 mg，利用液氮研磨成粉末，按照TRIzon總RNA提取試劑(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)說明提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)體系共20 μL：MgCl4 μL，dNTP 2 μL，10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，RNasin核糖核酸抑制劑0.5 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.6 μL，RNA 1 μg，Oligo(dT)引物1 μL，ddHO補(bǔ)充至20 μL。在42 ℃溫育60 min，95 ℃加熱5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 GmPUB24基因克隆

根據(jù)24在NCBI的基因號(GenBank登陸號LOC100811293)找到該基因序列的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(coding sequence，CDS)，使用Primer 5.0與SnapGene軟件設(shè)計(jì)克隆引物(上游引物PUB-F：5′-ATTCAACAGCAATCCCTTACC-3′，下游引物PUB-R：5′-ATCTCAGACCGTGTTTATG-3′)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系50 μL：cDNA模板2 μL，Master Mix 25 μL，ddHO 19 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，34個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.5 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]進(jìn)行膠回收，用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]進(jìn)行純化。將純化后的PCR產(chǎn)物連接載體pGEM-T easy，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，篩選白色的陽性菌落放置于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌16 h，取菌液PCR鑒定，選擇陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 生物信息學(xué)分析

將測序獲得的目的基因序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast同源比對。利用PridictProtein數(shù)據(jù)庫(https://predictprotein.org/)分析24編碼蛋白質(zhì)特征，ExPASy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析24編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，ExPASy ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)分析氨基酸的親水性與疏水性，SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl/)預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，SingnalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽，TMHMM Serve2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域，targetP 1.1 Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/index.php)預(yù)測編碼蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。在NCBI數(shù)據(jù)庫BlastP同源比對獲取不同物種PUB序列，利用Dnaman軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對，用MEGA7.0構(gòu)建不同物種蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用PlaceCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcarehtml)在線數(shù)據(jù)庫分析24啟動子順式作用元件。

1.7 qRT-PCR

分別于1、2、3、5、7、10 d取接種和未接種SCN的灰皮支黑豆根尖組織，經(jīng)液氮研磨，使用TRIzon Reagent(康維世紀(jì))提取RNA，使用DS-11FX分光光度計(jì)測定RNA的質(zhì)量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒RR047A(TaKaRa)將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。使用SnapGene設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，上游引物q-PUB-F1(5′-ATTCAACAGCAATCCCTTAC-3′)，下游引物q-PUB-R1(5′-GAAACGAAATGGGACAAA-3′)，擴(kuò)增片段164 bp。使用大豆4(登錄號：LOC100811293)基因作為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物，上游引物q-TUA-F2(5′-TGTGTACCAGTACCGATGTGGT-3′)，下游引物q-TUA-R2(5′-GCACTCCCGTGCCCGTAA-3′)，擴(kuò)增片段150 bp。qRT-RCR反應(yīng)體系20 μL： 2× TB Green Premix ExⅡ(TaKaRa) 10 μL、cDNA 4 μL、上下游引物各1 μL、ddHO 4 μL。使用BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR儀，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。每個處理做3次生物學(xué)重復(fù)，采用2法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。利用GraphPad Prism 9制作基因表達(dá)量柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmPUB24基因的克隆

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，菌液PCR產(chǎn)物與目的基因大小一致(圖1)；測序結(jié)果顯示，克隆的基因長度為1 626 bp。通過NCBI BLAST同源比對發(fā)現(xiàn)，與24基因序列一致，CDS總長1 254 bp，位于136～1 389處，編碼417個氨基酸。

M，DL2000 分子量標(biāo)記物；1～3，菌液樣品的3次重復(fù)。

2.2 GmPUB24編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

2.2.1 結(jié)構(gòu)與功能

24編碼的蛋白質(zhì)在9～75氨基酸處有一個U-box結(jié)構(gòu)域(圖2)，隸屬于RING E3泛素連接酶家族中一員。用PridictProtein數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)可能參與泛素化進(jìn)程，并與其他蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)生蛋白質(zhì)間的互作。該蛋白質(zhì)可能對幾丁質(zhì)反應(yīng)，發(fā)生蛋白質(zhì)的自泛素化。

圖2 GmPUB24基因編碼的蛋白質(zhì)U-box結(jié)構(gòu)域

2.2.2 理化性質(zhì)

大豆24共編碼417個氨基酸，異亮氨酸(Leu)占比最高，為12.7%；色氨酸(Trp)占比最低，為1.2%。等電點(diǎn)(pI)為9.02，分子量為46.78 ku，不穩(wěn)定系數(shù)為32.97，小于40，因此，該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.2.3 二級結(jié)構(gòu)

SOPMA在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果(圖3)顯示，24編碼的蛋白質(zhì)含有α螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈、β折疊，沒有β轉(zhuǎn)角。其中，α螺旋包含246個氨基酸，占58.9%；無規(guī)卷曲包含137個氨基酸，占32.85%；延伸鏈包含22個氨基酸，占5.28%；β折疊包含12個氨基酸，占2.88%。

紅色，延伸鏈；藍(lán)色，α-螺旋；綠色，β折疊；紫色，無規(guī)則卷曲。

2.2.4 親水性與疏水性

ExPASy ProtScale在線軟件分析結(jié)果(圖4)表明，24編碼蛋白質(zhì)的疏水性最大峰值為2.733，位于第306位的亮氨酸(Leu)，親水性峰值為-2.467，位于297位的賴氨酸(Lys)，其親水氨基酸所占比例為63.5%，疏水氨基酸所占比例為36.5%，說明該蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。

以0為界限，正值代表疏水氨基酸，負(fù)值代表親水氨基酸。

2.2.5 信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

SingnalP-5.0在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，GmPUB24蛋白質(zhì)信號肽僅占0.08%，因此，預(yù)測該蛋白質(zhì)不含有信號肽。TMHMM Serve2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)沒有跨膜區(qū)域。

2.2.6 亞細(xì)胞定位

targetP1.1serve預(yù)測結(jié)果顯示，GmPUB24定位在線粒體的可能性為3.6%，定位在細(xì)胞核的可能性為23.5%，定位在細(xì)胞質(zhì)的可能性為75.7%。用WOLF POST數(shù)據(jù)庫對該蛋白質(zhì)進(jìn)行相似定位蛋白質(zhì)分析，通過對比選出KPYC_SOLTU與目標(biāo)蛋白質(zhì)的相似度較高。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫對KPYC_SOLTU進(jìn)行分析可知，該蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞質(zhì)中，因此，推測出大豆24編碼的蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞質(zhì)中。

2.2.7 序列比對與蛋白質(zhì)進(jìn)化樹

在NCBI中查找相關(guān)的蛋白質(zhì)序列，利用blast進(jìn)行同源比對，找到豆科植物相關(guān)蛋白質(zhì)序列，使用Dnaman軟件對相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行序列比對。結(jié)果(圖5)顯示，GmPUB24與豆科植物在U-Box結(jié)構(gòu)域處同源性均較高，與模式植物擬南芥和禾本科作物水稻、玉米差異較大。利用MEGA5.0軟件對12條蛋白質(zhì)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果(圖6)表明，目的蛋白與野生大豆(KAG4974237)同源性最高，與栽培大豆(XP_003539150)、豇豆(XP_027911296)、小綠豆(XP_014523587)、紅豆(XP_027348689)、木豆(KYP39063)、鷹嘴豆(XP_004506267)同源性較高，與擬南芥(OAP04810)、番茄(XP_004229574)、水稻(XP_015635733)、玉米(PWZ26684)親緣性較低。

黑色陰影為氨基酸具有100%一致性，粉色表示一致性在75%以上，藍(lán)色表示一致性在50%-75%，白色表示一致性在50%以下。KAG4974237，野生大豆；XP_003539150，栽培大豆；XP_027911296，豇豆；XP_014523587，小綠豆；XP_027348689，紅豆；KYP39063，木豆；XP_004506267，鷹嘴豆；OAP04810，擬南芥；XP_004229574，番茄；XP_015635733，水稻；PWZ26684，玉米。下同。

采用鄰接法，自舉檢驗(yàn)1 000次；圖中標(biāo)尺為遺傳距離。

2.3 GmPUB24啟動子順式作用元件分析

由表1可知，24基因上游1 500 bp序列存在參與脫落酸反應(yīng)的元件、與光反應(yīng)有關(guān)的保守DNA元件、茉莉酸反應(yīng)元件、分生組織相關(guān)表達(dá)元件，以及啟動子和增強(qiáng)子區(qū)常見的順式作用元件、核心啟動子30位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄元件等。

表1 GmPUB24啟動子順式元件分析

2.4 GmPUB24的胞囊線蟲誘導(dǎo)表達(dá)

2.4.1 qRT-PCR引物特異性檢測

以大豆根尖提取的cDNA為模板，使用24與內(nèi)參基因4的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖7所示，兩條帶大小分別為164 bp與150 bp，條帶清晰無雜帶、無引物二聚體、無發(fā)卡結(jié)構(gòu)，說明兩對引物的特異性較好，可以用于qRT-PCR分析。

M， DL2000 分子量標(biāo)記物; 1， TUA4; 2， GmPUB24.

2.4.2 qRT-PCR結(jié)果

為了明確24在大豆胞囊線蟲侵染大豆后的誘導(dǎo)表達(dá)情況，分別在接種胞囊線蟲后1、2、3、5、7、10 d取灰皮支黑豆根尖RNA，檢測24基因的表達(dá)量。結(jié)果如圖8所示，在1、2、3 d 接種樣本的24相對表達(dá)量與未接種樣本相比顯著升高，第1、2天24相對表達(dá)量分別是未接種樣本的1.64、2.49倍，第3天24相對表達(dá)量是未接種樣本的6.14倍，并且顯著高于與第1、2天的相對表達(dá)量。第5天接種樣本的24相對表達(dá)量顯著降低，是未接種樣本的45%；在第7和10天表達(dá)量分別為未接種樣本的4.86倍和2.67倍。以上結(jié)果說明，大豆胞囊線蟲侵染大豆的前期，24會被不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)，推斷24可能參與大豆抵御胞囊線蟲的過程。

**代表P≤0.01，***代表P≤0.001，ns代表差異不顯著。

3 討論

植物U-box蛋白是一類重要的E3泛素連接酶，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為兩大類，第一類僅含有U-Box結(jié)構(gòu)域，第二類包含U-Box與其他結(jié)構(gòu)域或激酶的復(fù)合體，例如U-Box+ARM、U-Box+Ser/Thr、MIF4G+U-Box等。本研究克隆到的24基因編碼的蛋白質(zhì)在C端只含有U-Box結(jié)構(gòu)域，不含有其他結(jié)構(gòu)域。24基因啟動子區(qū)有2個參與茉莉酸反應(yīng)的順式調(diào)控元件CGTCA-motif與TGACG-motif，其中，TGACG-motif多出現(xiàn)在真菌和細(xì)菌誘導(dǎo)啟動子中。已有研究表明，在受線蟲侵染的植物結(jié)構(gòu)中，一些植物基因表達(dá)水平發(fā)生了變化，這些基因的啟動子可能受線蟲誘導(dǎo)表達(dá)。也有研究表明，防衛(wèi)基因啟動子中的元件是應(yīng)答激素反應(yīng)的必要順式作用元件。在24啟動子區(qū)也發(fā)現(xiàn)了ABA反應(yīng)元件(ABRE)，預(yù)測該基因可能參與大豆抵御ABA的過程。大豆基因1會在GmbZIP44、GmbZIP62和GmbZIP78s蛋白作用下激活A(yù)BA反應(yīng)元件(ABRE)提高大豆對ABA的抗性。24啟動子區(qū)還包含WUN-motif傷口反應(yīng)元件；木薯受到病原菌侵染產(chǎn)生傷口時，木薯6基因激活WUN-motif傷口反應(yīng)元件進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶相關(guān)基因?qū)е碌矸酆糠e累。胞囊線蟲侵染大豆根系與建立取食位點(diǎn)時，都會對植株造成傷口，由此推測24基因的WUN-motif傷口反應(yīng)元件也受到胞囊線蟲侵染的影響。

接種SCN 12 h后，SCN已經(jīng)侵染大豆根部，大豆轉(zhuǎn)錄本豐度發(fā)生變化。接種SCN 3 d后，SCN在大豆根部選擇細(xì)胞并開始建立取食位點(diǎn)，第8天前完成合胞體的建立。本研究在接種SCN后，24基因被誘導(dǎo)表達(dá)，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第3天表達(dá)量為最高，推測24基因可能參與大豆抵御SCN侵染前期取食位點(diǎn)建立的過程。通常植物不能長時間保持基因的高表達(dá)，接種SCN第5天，24基因表達(dá)量降低，這與王晗等的研究結(jié)果類似，木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因G55、4、85基因在抗病品種小粒黑豆被大豆胞囊線蟲誘導(dǎo)表達(dá)，也呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的現(xiàn)象。

4 結(jié)論

抗大豆胞囊線蟲灰皮支黑豆(ZDD2315)24屬于U-Box家族基因，編碼區(qū)具有417個氨基酸，編碼蛋白為親水蛋白且無跨膜結(jié)構(gòu)域，無信號肽，定位于細(xì)胞質(zhì)中。蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，GmPUB24與野生大豆親緣性最高。在啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了CGTCA-motif、TGACG-motif等響應(yīng)抗病通路的作用元件，以及ABRE、WUN-motif、TATA-box等響應(yīng)非生物脅迫的作用元件，而且24基因會被大豆胞囊線蟲誘導(dǎo)表達(dá)。