副干酪乳桿菌TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)小鼠Ⅱ型糖尿病的干預(yù)作用

唐銘，高聰聰，王寧宇，胡梅梅，韓雪梅，王海寬*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司，天津 300457）

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，目前，病因和發(fā)病機(jī)理尚未完全認(rèn)識(shí)。長(zhǎng)期存在的高血糖會(huì)造成各種組織和器官，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害和功能障礙，甚至導(dǎo)致器官衰竭，給人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)嚴(yán)重影響[1]。糖尿病是一個(gè)終身疾病，目前醫(yī)學(xué)水平無(wú)法根除治愈，需要患者終身用藥和治療[2]。早期糖尿病往往癥狀不明顯，不易被察覺(jué)，因此，早期糖尿病以干預(yù)生活方式為主。帶病生存是所有糖尿病人群的現(xiàn)狀，因此，尋找到一種能夠緩解糖尿病、延緩并發(fā)癥的發(fā)生進(jìn)程的輔助性食品迫在眉睫。

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）是一種被廣泛用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中誘發(fā)糖尿病的化學(xué)物質(zhì)，對(duì)動(dòng)物的胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用，相比操作復(fù)雜的、周期長(zhǎng)的基因動(dòng)物，通過(guò)化學(xué)藥物損傷胰島功能，從而誘導(dǎo)糖尿病的操作簡(jiǎn)單、成本低、應(yīng)用更廣泛[3]。STZ對(duì)其他組織器官毒性相對(duì)較小，適量注射能誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病，造模成功率較高，是目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的糖尿病模型化學(xué)誘導(dǎo)劑[4]。

目前，常見(jiàn)的降血糖藥有磺脲類藥物、雙胍類藥物、胰島素增敏劑和α-葡萄糖苷酶抑制劑等。這些藥物在治療疾病的同時(shí)也會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生一系列副作用，如頭暈、頭痛、嘔吐、腹痛、腸脹氣和腹瀉等不良反應(yīng)[5]。近年來(lái)的研究表明，益生菌食品具有一定的降糖功效，對(duì)糖尿病有一定的緩解作用。如Wang等[6]研究表明益生菌可以降低高血糖水平，改善餐后血糖及對(duì)葡萄糖的耐受作用，并減輕胰腺炎癥，從而緩解糖尿病。羅龍龍等[7]證實(shí)乳酸菌可以通過(guò)降低胰島水平，達(dá)到降血糖的目的，對(duì)糖尿病人有良好的治療療效。另有研究表明，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的某種活性物質(zhì)對(duì)緩解糖尿病有一定的效果，謝玉鋒等[8]的研究發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中，能將豆?jié){中的某些大分子物質(zhì)降解產(chǎn)生小分子物質(zhì)，而小分子物質(zhì)的生物活性更強(qiáng)，具有更好的降血糖效果，同時(shí)通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶活性，減緩腸道生成葡萄糖的速度，達(dá)到降低血糖、緩解其病癥的目的，從而預(yù)防和治療糖尿病。

本實(shí)驗(yàn)中采用的副干酪乳桿菌TK1501（Lactobacillus paracasei TK1501）屬于乳桿菌屬，作為一種益生菌，具有增強(qiáng)免疫力、維持腸道菌群平衡、降血壓、降血脂、降血糖和降膽固醇等功效[9]。大豆的營(yíng)養(yǎng)成分非常豐富，其蛋白質(zhì)含量非常高，除糖類較低外，其他營(yíng)養(yǎng)成分，如脂肪、鈣、磷、鐵和維生素B1、維生素B2等人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量都較高，是一種理想的優(yōu)質(zhì)植物蛋白食物。Ascencio等[10]的研究結(jié)果指出,由于血液中的胰島素可以由大豆蛋白通過(guò)影響膽固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白-1的表達(dá)來(lái)調(diào)控，因此，通過(guò)攝入一些含有大豆植物蛋白的食物能降低膽固醇和甘油三酯的積累預(yù)防脂肪肝。謝玉鋒等[11]將來(lái)源于Lactobacillus paracasei TK1501的β-葡糖苷酶基因連接于表達(dá)載體pET28a（+）上，在 E．coli BL21 中進(jìn)行表達(dá)，重組酶經(jīng)鎳離子親和層析分離得到純酶，實(shí)現(xiàn)了糖苷類物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)β-葡糖苷酶有益于水解大豆異黃酮和合成糖苷，而水解后的大豆異黃酮有益于控制患者血漿胰島素水平和葡萄糖水平，進(jìn)而緩解糖尿病。

大豆粉是大豆經(jīng)烘烤和粉碎制成的食品，因具有豐富的膳食纖維，能有效阻止糖的過(guò)量吸收，且含糖量較低、營(yíng)養(yǎng)豐富、含有大量的卵磷脂，有一定的降血糖和降血脂的作用，適合作為糖尿病患者的日用性食品[13]。目前，針對(duì)利用副干酪乳桿菌發(fā)酵大豆粉治療糖尿病的研究鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)喂食小鼠L.paracasei TK1501發(fā)酵后的大豆粉，研究其對(duì)小鼠Ⅱ型糖尿病的干預(yù)作用，探討其對(duì)糖尿病的作用效果。L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)糖尿病的干預(yù)作用具有重要的研究意義，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為開(kāi)發(fā)一款能夠緩解糖尿病病癥且不損害健康的日用性食品提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4周齡～5周齡級(jí)昆明雄鼠，體重（25±2）g：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司；高糖高脂飼料（67%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉）、基礎(chǔ)飼料：科澳協(xié)力飼料廠。

鏈脲佐菌素（USP級(jí)，98.5%，貨號(hào)S17049）、肝糖原、膽固醇（totalcholestrol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein，LDL-c）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein，HDL-c）檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；檸檬酸（99.0%）、葡萄糖（99.8%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（AB204-S）：梅特勒—托利多儀器（上海）公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9240A）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)（GL20A）：湖南湘儀離心機(jī)器有限公司；高效液相色譜儀（1200 Infinity）：美國(guó)安捷倫公司；血糖儀及試紙（580型）：江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；酶標(biāo)儀（1500型）：賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的制備

將保存于-80℃的L.paracasei TK1501以1%的接種量接種至5%脫脂奶粉液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3代后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉的制備

將活化后的L.paracasei TK1501種子液接種至大豆粉固體培養(yǎng)基[料液比 1∶0.6（g/mL）]中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，于50℃烘箱干燥，控制含水量≤12%，制備L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉。

1.3.3 小鼠建模與分組

取 4周齡～5周齡、體重（25±2）g的SPF級(jí)昆明雄鼠40只，隨機(jī)分成4組（每組10只）：空白組、模型組、L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉組、未發(fā)酵大豆粉組。鼠房控制溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，晝夜循環(huán)，自由飲食飲水，基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。1周后模型組、L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉組、未發(fā)酵大豆粉組飼喂高脂高糖飼料3周。第4周起腹腔注射10 mg/mL STZ 75 mg/kg體重，注射前禁食12 h左右，連續(xù)注射3 d，建立糖尿病模型，同時(shí)，空白組注射檸檬酸緩沖溶液（0.1 mol/L，pH4.5）。建模后尾部采血隨機(jī)測(cè)定小鼠血糖，血糖值＞11.1 mmol/L即為建模成功。建模成功后以0.182 g/mL、0.4 mL的劑量分別利用L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉、未發(fā)酵豆粉干預(yù)4周，模型組利用等量生理鹽水灌胃。

1.3.4 小鼠形態(tài)觀察

觀察小鼠飲水量、飲食量、精神狀態(tài)、毛發(fā)、排尿情況等，并記錄。

1.3.5 小鼠體重的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每周同一時(shí)間對(duì)小鼠體重進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 小鼠空腹血糖的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每周測(cè)定前小鼠隔夜禁食不禁水12 h，采用尾部采血的方式，測(cè)定其空腹血糖值。

1.3.7 小鼠糖耐量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第9周小鼠隔夜禁食不禁水12 h，以2 g/kg的劑量灌胃20%葡萄糖溶液，尾部采血分別測(cè)定第0、15、30、60、90 min 和 120 min 時(shí)小鼠血糖值。

1.3.8 小鼠血液及組織采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，4組小鼠均隔夜禁食12 h后稱重，采用眼球取血法收集血液標(biāo)本，斷頸處死。解剖并迅速取出胰腺、肝臟和腎臟于冰冷的生理鹽水中沖洗。將血液樣品在4℃條件下3 000×g離心10 min，收集血清置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.9 肝臟中相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

肝臟組織與0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液按質(zhì)量比1∶10的比例混勻，用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，10 000×g離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明書的步驟測(cè)定肝糖原的含量。

1.3.10 血脂指標(biāo)的測(cè)定

利用試劑盒對(duì)血脂中的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.11 臟器組織病理學(xué)研究

將低溫保存的胰腺、肝臟和腎臟進(jìn)行H&E染色切片。

1.3.12 L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉前后大豆異黃酮含量變化的測(cè)定

采用高效液相色譜法進(jìn)行大豆異黃酮含量的測(cè)定，色譜條件：檢測(cè)柱 Hypersil ODS2（C18）（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇+0.1%乙酸（體積分?jǐn)?shù)），水+0.1%乙酸（體積分?jǐn)?shù)）；流速1 mL/min；柱溫27℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。采用黃豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、黃豆黃苷、黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉前后樣品中的大豆異黃酮含量進(jìn)行定量定性分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本實(shí)驗(yàn)中采用3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值，應(yīng)用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，液相圖譜使用自帶的色譜工作站進(jìn)行分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠形態(tài)觀察

不同組別小鼠的形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 不同組別小鼠的形態(tài)Fig.1 Morphology of mice in different groups

空白組小鼠體型勻稱，皮毛有光澤，飲食、飲水、排尿正常，行動(dòng)機(jī)敏，精神狀態(tài)較好。模型組小鼠體型消瘦，毛發(fā)稀疏且發(fā)黃，飲食、飲水量大，尿多，行動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍。L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉組小鼠體型與模型組相比較大，飲食、飲水量相對(duì)減少，排尿相對(duì)減少，行動(dòng)、精神狀態(tài)均有所改善，表明L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)STZ誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型糖尿病模型小鼠外觀形態(tài)、生存狀態(tài)等有明顯的改善作用。

2.2 L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)小鼠體重的影響

L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)小鼠體重的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同組別小鼠體重的變化Fig.2 Changes in body weight of mouse in different groups

前3周空白組小鼠體重先上升，后呈逐漸趨于平緩的趨勢(shì)，喂食高糖高脂飼料的小鼠體重不斷增加。除空白組外，其余組別小鼠第4周開(kāi)始連續(xù)3 d注射STZ，體重整體呈迅速下降的趨勢(shì)。喂食L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉組體重雖沒(méi)有顯著上升，但與模型組小鼠相比，下降趨勢(shì)較平緩，初步判斷L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠的體重下降具有輕微的緩解作用。

2.3 L.paracaseiTK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)小鼠血糖的影響

L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)小鼠血糖的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同組別小鼠血糖值的變化Fig.3 Changes in blood glucose levels of mice in different groups

除空白組外，其余組別小鼠第4周開(kāi)始連續(xù)注射STZ后血糖持續(xù)上升。第5周灌胃后，模型組小鼠血糖整體呈上升趨勢(shì)；L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉組小鼠血糖先緩慢上升，后逐漸下降，與模型組相比存在明顯的下降趨勢(shì)；未發(fā)酵大豆粉組血糖緩慢上升后逐漸趨于穩(wěn)定，但仍遠(yuǎn)高于正常水平。進(jìn)一步說(shuō)明，L.paracaseiTK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)小鼠血糖具有緩解作用。

2.4 L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)小鼠糖耐量的影響

口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)是一種葡萄糖負(fù)荷實(shí)驗(yàn)，用以了解胰島β細(xì)胞功能和機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力，是確診糖尿病的重要指標(biāo)，當(dāng)糖耐量出現(xiàn)異常時(shí)，可初步判定為糖尿病[14]。L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)小鼠糖耐量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同組別小鼠血糖的變化Fig.4 Changes in blood glucose of mice in different groups

由圖4可見(jiàn)，小鼠經(jīng)口服灌胃葡萄糖后，血糖值約在15 min～60 min達(dá)到最高值。對(duì)比不同組別小鼠血糖值的下降趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)，空白組小鼠在15 min時(shí)血糖值達(dá)到最高值，隨后開(kāi)始逐漸降低；L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉組小鼠血糖值在30 min后迅速下降，120 min后血糖值下降更加明顯，且逐漸趨于空白組水平；模型組小鼠的血糖值在60 min后雖存在下降趨勢(shì)，但仍處于較高水平，且120 min后血糖值遠(yuǎn)高于正常血糖水平。上述結(jié)果表明，與模型組相比，L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)患病小鼠的葡萄糖耐受能力有顯著的改善作用（p＜0.05），糖耐量得到一定程度的恢復(fù)，從而反應(yīng)胰島功能得到好轉(zhuǎn)。

2.5 L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)小鼠肝糖原的影響

肝糖原是一種由多葡萄糖聚合而成的物質(zhì)，在調(diào)節(jié)血糖方面發(fā)揮著核心作用，主要儲(chǔ)存于肝臟中，用于為機(jī)體提供能量[15-16]。肝糖原的合成和降解受胰島素、胰高血糖素等激素的調(diào)控，當(dāng)激素控制失調(diào)，糖原的分解和糖異生增加，就會(huì)導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生，因此，糖尿病患者的肝糖原含量較健康人群相比往往較低[17]。L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)小鼠肝糖原的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同組別小鼠肝糖原含量Fig.5 Liver glycogen content of mice in different groups

由圖5可見(jiàn)，經(jīng)STZ誘導(dǎo)的模型組小鼠糖原含量遠(yuǎn)低于空白組健康小鼠，表示模型組小鼠體內(nèi)激素調(diào)節(jié)紊亂，肝臟受損，機(jī)體合成糖原的能力大大減小。經(jīng)L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉干預(yù)的小鼠糖原含量與模型組相比顯著性升高（p＜0.05）。推測(cè)可能是由于肝功能增強(qiáng)，并調(diào)控了肝臟對(duì)糖原的合成、儲(chǔ)存、分解等代謝過(guò)程，從而減輕胰島素抵抗，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胰島素的利用，患病小鼠體內(nèi)肝糖原增加[18]。

2.6 L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)小鼠血脂指標(biāo)的影響

不同組別小鼠TC、HDL-c、LDL-c的變化見(jiàn)圖6，不同組別中小鼠TG的含量見(jiàn)圖7。

圖6 不同組別小鼠TC、HDL-c、LDL-c的變化Fig.6 Changes of TC，HDL-c and LDL-c in different groups of mice

圖7 不同組別中小鼠TG含量Fig.7 TG content of mice in different groups

總膽固醇（TC）是指血液中所有脂蛋白所含膽固醇之總和，即結(jié)合膽固醇和游離膽固醇的總和[19]。其中起關(guān)鍵作用的是高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c），具有促進(jìn)組織細(xì)胞內(nèi)膽固醇的清除、維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇量的相對(duì)恒定的作用[20]。如圖6所示，模型組小鼠體內(nèi)TC、低密度脂蛋白（LDL-c）較健康小鼠大幅增加，而HDL-c明顯減少。經(jīng)L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉干預(yù)的小鼠TC與模型組相比極顯著降低（p＜0.01），LDL-c顯著降低（p＜0.05），且 HDL-c極顯著升高（p＜0.01）?？梢?jiàn)L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)小鼠TC、HDL-c和LDL-c具有調(diào)節(jié)作用，減輕脂肪代謝紊亂的發(fā)生，降低血糖控制的難度，進(jìn)而緩解糖尿病對(duì)機(jī)體造成的危害。

甘油三酯（TG）是檢測(cè)糖尿病的重要指標(biāo)之一，TG過(guò)高會(huì)導(dǎo)致肝功能異常、增加誘發(fā)糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，從而危害身體健康[21-22]。如圖7，喂食L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉小鼠的TG雖然高于健康小鼠，但較模型組小鼠相比，存在明顯的降低趨勢(shì)，推測(cè)L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)降低小鼠TG存在積極作用，患病小鼠的肝功能因此有所改善，從而加強(qiáng)TG的代謝，延緩糖尿病的發(fā)展進(jìn)程。

2.7 組織病理學(xué)分析結(jié)果

組織病理學(xué)檢查結(jié)果如圖8～圖10所示。

圖8 光學(xué)顯微鏡下不同組別小鼠胰腺組織病理切片（×200）Fig.8 Histopathological sections of mice pancreatic tissue in different groups under light microscope（×200）

圖9 光學(xué)顯微鏡下不同組別小鼠肝臟組織病理切片（×200）Fig.9 Pathological sections of liver tissues of different groups of mice under light microscope（×200）

圖10 光學(xué)顯微鏡下不同組別小鼠腎臟組織病理切片（×200）Fig.10 Pathological sections of kidney tissues of different groups of mice under light microscope（×200）

圖8（a）中空白組小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)正常，邊界分明，胰島細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯脫落現(xiàn)象和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；圖8（b）中模型組小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)邊界模糊，胰島細(xì)胞排列松散，甚至萎縮，胰腺組織損傷明顯；圖8（c）中經(jīng)L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉干預(yù)的小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)與模型組相比較，胰島細(xì)胞萎縮減少，損傷明顯有所改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象得到緩解。

圖9（a）中空白組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細(xì)胞排列有序；圖9（b）中模型組小鼠肝臟脂肪明顯增加，受損嚴(yán)重，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死；圖9（c）中經(jīng)L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉干預(yù)的小鼠肝臟脂肪減少、細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，損傷有所改善。

圖10（a）中空白組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)炎性細(xì)胞，腎小球無(wú)病變；圖10（b）中模型組小鼠腎臟出現(xiàn)炎性細(xì)胞，腎小球系膜細(xì)胞發(fā)生病變，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)脫落，腎臟受損嚴(yán)重；圖10（c）中經(jīng)L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉干預(yù)的小鼠腎臟病變情況有所改善，損傷得到明顯緩解。通過(guò)組織病理學(xué)檢查顯示，經(jīng)L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉干預(yù)后的糖尿病小鼠的胰腺、肝臟和腎臟的病理切片炎癥均有所改善，對(duì)緩解患病小鼠臟器受損的情況效果顯著。

2.8 L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉前后大豆異黃酮含量變化

大豆異黃酮是大豆或苜蓿等植物產(chǎn)生的黃酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于大豆及其制品中，具有抗氧化、抗腫瘤，緩解糖尿病等功效；但其有效成分主要以苷元型黃酮的形式存在，不易被人體消化和吸收[23]。大豆異黃酮中苷元型黃酮在人體內(nèi)吸收程度遠(yuǎn)高于糖苷型黃酮，有益于控制糖尿病患者血漿中胰島素水平和葡萄糖水平,從而達(dá)到控制糖尿病進(jìn)程的目的[23]。利用L.paracasei TK1501對(duì)大豆粉進(jìn)行發(fā)酵后，某些物質(zhì)將結(jié)合型糖苷類黃酮轉(zhuǎn)化為游離型苷元類黃酮，其糖苷類物質(zhì)的含量均有所降低，苷元類物質(zhì)的含量均有所增加，提高了機(jī)體對(duì)黃酮的利用效果。本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法對(duì)大豆粉中的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖11所示。

圖11 L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉前后大豆異黃酮含量變化Fig.11 Changes of soybean isoflavone content before and after fermentation of L.paracasei TK1501 soybean meal

在利用L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉前，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷的含量較高，發(fā)酵后大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的含量分別提高了7.50、5.96、3.49 mg/100 g，表明L.paracasei TK1501可以利用糖苷型黃酮，并將其轉(zhuǎn)化為易于人體吸收的苷元型黃酮，更有利于糖尿病患者食用。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

糖尿病為慢性代謝性疾病之一，Ⅱ型糖尿病患者占糖尿病患者總數(shù)的90%以上，由于生活方式、環(huán)境、人口老化等多方面的因素導(dǎo)致其發(fā)病率逐年上升，尤其是Ⅱ型糖尿病的發(fā)生呈現(xiàn)越來(lái)越年輕化，35歲以上人群為高發(fā)人群，越來(lái)越多的人受到該疾病的困擾[24-25]。目前，Ⅱ型糖尿病的發(fā)病趨勢(shì)不容樂(lè)觀，是全球范圍內(nèi)發(fā)病率增長(zhǎng)最快的疾病之一，糖尿病已成為全球性疾病，可能會(huì)使成年患者致死、致殘[26]。糖尿病作為一種不可治愈的疾病，需終身服藥，而藥物的毒副作用會(huì)使患者損傷。因此，開(kāi)發(fā)一款保健且副作用極小的保健食品迫在眉睫。

大豆及其制品在發(fā)酵后產(chǎn)生獨(dú)特的香氣，部分糖苷型黃酮被轉(zhuǎn)化為苷元型黃酮，更容易被人體消化吸收。Otieno等[27]的研究結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵大豆制品產(chǎn)生的異黃酮能降低血脂和血糖，具有預(yù)防心腦血管疾病等功能。Chen等[28]發(fā)現(xiàn)，在植物乳桿菌和副干酪乳桿菌混合厭氧固態(tài)發(fā)酵扁豆時(shí)表現(xiàn)出優(yōu)異的DPPH自由基清除能力和氧化自由基吸收能力以及較低的α-葡萄糖苷酶活性，同時(shí)，抗氧化活性增強(qiáng)，相應(yīng)的產(chǎn)品對(duì)Ⅱ型糖尿病患者有益。Khosravi等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵類黃豆制品在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的金雀異黃素和大豆苷元，以劑量依賴的方式，增加胰島素刺激細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，從而達(dá)到降低血糖的目的；同時(shí)發(fā)酵后的糖苷多酚通過(guò)β-葡萄糖苷酶的作用轉(zhuǎn)化為苷元形式，這些轉(zhuǎn)化能提高酚類化合物在人體腸道中的利用能力，從而產(chǎn)生更高的有益治療效果，如抗癌、抗肥胖、神經(jīng)保護(hù)和抗糖尿病等。因此，乳酸菌發(fā)酵大豆制品在糖尿病領(lǐng)域的應(yīng)用和研究受到越來(lái)越多的科研人員的關(guān)注，已經(jīng)成為熱點(diǎn)。

3.2 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)以L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉能夠有效改善患病小鼠體重、血糖、糖耐量、肝糖原、膽固醇和甘油三酯等各項(xiàng)指標(biāo)。數(shù)據(jù)顯示，小鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力顯著提高，肝臟中肝糖原含量顯著上升，同時(shí)，小鼠的各項(xiàng)血脂指標(biāo)均得到顯著改善。組織病理學(xué)分析結(jié)果顯示，L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)患病小鼠的胰島、肝臟和腎臟的損傷具有明顯的改善效果，能夠減輕病理學(xué)改變，尤其是肝臟脂肪、胰腺和腎臟炎性細(xì)胞明顯減少。這些結(jié)果表明，L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)患病小鼠的臟器受損有改善作用。

綜上所述，L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉通過(guò)利用糖苷型黃酮轉(zhuǎn)化為易于人體吸收的苷元型黃酮，輔助降血糖作用效果顯著，是一款適合糖尿病患者食用且有益于輔助降血糖的食品。未來(lái)需進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以確定L.paracasei TK1501發(fā)酵大豆粉對(duì)緩解Ⅱ型糖尿病發(fā)生和發(fā)展的其它活性物質(zhì)和作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)具有輔助降血糖功能的保健食品提供更廣泛的思路。