生菜多酚氧化酶的酶活特性及碳點(diǎn)對(duì)其抑制作用

李宏，李秋蘭，于麗娟，普紅梅，楊德志，李雪瑞，楊亞玲*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650033；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

生菜（Lactuca sativa L.）是葉用萵苣的俗稱(chēng)，質(zhì)地鮮嫩，清香可生食。生菜具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有多種維生素和礦物質(zhì)，其中萵苣素具有促進(jìn)人體血液循環(huán)和催眠利尿的作用[1]。食用生菜能夠幫助消化，改善便秘[2]。生菜含水量較高，但收獲后水分容易蒸發(fā)，在貯藏、運(yùn)輸過(guò)程中經(jīng)常發(fā)生褐變、腐爛、葉片變黃等現(xiàn)象，不利于其長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)藏[3]。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是在水果、蔬菜發(fā)生酶促褐變過(guò)程中的主要酶類(lèi)[4]，其作為一種在自然界中分布廣泛的含銅末端氧化還原酶[5-6]，在氧氣存在下能催化鄰苯二酚氧化成鄰苯二醌[7]，醌與植物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)絡(luò)合或自身聚合，形成褐色或黑色多聚物醌類(lèi)物質(zhì)[8]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于抑制水果蔬菜PPO活性的研究較多，且已有抑制方法，如降低氧含量的物理方法和添加亞硫酸鹽類(lèi)、含硫有機(jī)化合物、抗壞血酸等抑制劑的化學(xué)方法[9]。近年來(lái)有學(xué)者研究表明抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、檸檬酸對(duì)生菜PPO活性有抑制效果[10-11]。

碳點(diǎn)（carbon dots，CDs）是一類(lèi)尺寸在10 nm以?xún)?nèi)的球形或類(lèi)球形的納米粒子[13]。作為碳納米材料家族的新成員[14]，自2004年[15-16]發(fā)現(xiàn)以來(lái)，因其具有原料成本低、易于合成、水溶性好、表面易功能化、環(huán)境友善、優(yōu)越的物化性質(zhì)等特點(diǎn)[17-19]，引起了各行各界廣泛的關(guān)注。在生物熒光成像[20]、生物傳感[21]、化學(xué)分析[22]、光催化[23]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。這些特性與碳點(diǎn)表面的官能團(tuán)的種類(lèi)和數(shù)量密不可分。碳點(diǎn)表面的還原性基團(tuán)—OH、—SH等的存在使碳點(diǎn)具備還原性能，使其可應(yīng)用于PPO抑制。與常用PPO抑制劑相比，其安全性、抑制效果等都具備一定優(yōu)勢(shì)。但碳點(diǎn)在PPO抑制劑方面的應(yīng)用卻鮮有研究。

本文對(duì)生菜根莖中PPO進(jìn)行粗提，研究其酶活特性，制備了 3種不同摻雜的碳點(diǎn)（S-CDs、Br-CDs、Cu-CDs），研究了CDs對(duì)生菜PPO活性的抑制性能，提供了一種新的PPO抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生菜：市售。谷胱甘肽、十六烷基三甲基溴化銨、檸檬酸、磷酸氫二鈉、鄰苯二酚、間苯二酚、對(duì)苯二酚、苯酚、鄰苯三酚、抗壞血酸、尿素、甘氨酸、乙二胺四乙酸二鈉銅（ethylenediaminetetraacetic acid copper disodium salt，EDTACu-2Na）：阿拉丁試劑上海有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SX2-5-12馬弗爐：上海力辰邦西儀器科技有限公司；T-50.1 L砂芯溶劑過(guò)濾器（濾頭孔徑10 μm）：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京通用分析儀器有限公司；HH-4型恒溫水浴鍋：金壇市富華電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 碳點(diǎn)合成

分別以谷胱甘肽、十六烷基三甲基溴化銨、乙二胺四乙酸二鈉銅為原料，采用水熱法[24-25]制備硫摻雜、溴摻雜、銅摻雜的碳點(diǎn)（S-CDs、Br-CDs、Cu-CDs）。

將1.5 g谷胱甘肽溶解于100 mL蒸餾水中，待完全溶解后將溶液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，再置于馬弗爐中，在200℃的溫度下反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后取出，自然冷卻至室溫。再使用砂芯溶劑過(guò)濾器加0.2 μm的濾膜真空抽濾，然后將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min條件下離心30 min。待離心結(jié)束棄掉下層沉淀，所得上清液即為S-CDs，制備好的溶液置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

Br-CDs制備：稱(chēng)取十六烷基三甲基溴化銨1.82 g和尿素0.606 g、甘氨酸0.75 g溶解于40 mL蒸餾水中，完全溶解后將溶液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，再置于馬弗爐中，在200℃的溫度下反應(yīng)8 h。冷卻后處理步驟與S-CDs一致。

Cu-CDs制備：稱(chēng)取0.4 g乙二胺四乙酸二鈉銅，溶解于40 mL水中，加入0.1 g檸檬酸和100 μL乙二胺，溶解后轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜，于馬弗爐中200℃反應(yīng)8 h。冷卻后處理步驟與S-CDs一致。

1.3.2 生菜PPO提取方法

參考胡金強(qiáng)等[11]的方法，對(duì)生菜根莖的PPO進(jìn)行粗提。將新鮮的生菜根部迅速去皮，取25g樣品，加入50 mL磷酸緩沖液（4℃預(yù)冷，pH值為7，濃度50 mmol/L），制成勻漿，在4℃，轉(zhuǎn)速8 500 r/min的冷凍離心機(jī)上離心15 min，取上清液即為生菜PPO粗提液。

1.3.3 生菜PPO活性的測(cè)定

以0.3 mL鄰苯二酚（濃度為0.3 mol/L）為底物，取2.6 mL的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH值為6）與之混勻，加入0.1 mL的酶粗提液，40℃反應(yīng)10 min，于420 nm處測(cè)定產(chǎn)物的吸光度，表示其活性大小。

1.3.4 底物專(zhuān)一性

在2.6 mL緩沖液（pH值為6.2）和0.1 mL酶粗提液的混合溶液中分別加入0.3 mL不同的酚（對(duì)苯二酚、間苯二酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、苯酚，濃度均為0.3 mol/L）作為底物，混勻，在21℃條件下水浴加熱10 min，測(cè)定420 nm處吸光度。

1.3.5 反應(yīng)pH值對(duì)生菜PPO活性的影響

配制不同pH值的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH值在4～8之間），各取2.6 mL于5支試管中，分別加入0.3 mL的鄰苯二酚和0.1 mL的生菜PPO粗提液，渦旋混勻后在21℃反應(yīng)10 min，于420 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.6 反應(yīng)溫度對(duì)生菜PPO活性的影響

取2.6 mL的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH值為6）和0.3 mL的鄰苯二酚與0.1 mL的PPO混勻后，于不同溫度（4、10、20、30、40、50、60 ℃）下加熱 10 min，在420 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.7 不同抑制劑對(duì)生菜PPO活性的影響

在2.6 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH值為6）、0.3 mL鄰苯二酚和0.1 mL酶粗提液的混合體系中分別加入0.5 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的檸檬酸、抗壞血酸、半胱氨酸、S-CDs、Br-CDs、Cu-CDs溶液。旋渦混勻后于40℃反應(yīng)10 min，于420 nm處測(cè)定吸光度。以不加抑制劑時(shí)的酶活為對(duì)照，加抑制劑時(shí)的酶活與不加入抑制劑時(shí)的酶活的比值表示抑制效果，低于對(duì)照組（不加抑制劑）即相對(duì)活性小于100%表示有抑制效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳點(diǎn)的結(jié)構(gòu)表征

為了了解S-CDs的形貌及其結(jié)構(gòu)特征，對(duì)碳點(diǎn)進(jìn)行了透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）和傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）、X射線(xiàn)光電子能譜儀（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）表征，結(jié)果如圖1所示。

圖1 S-CDs的表征圖譜Fig.1 Characterization spectras of S-CDs

從圖1a中可以看出，合成的S-CDs呈球形，且粒徑均勻，分散性較好，粒徑分布大約為（2.8±0.4）nm。由圖1b可知，3 404 cm-1處左右的寬峰對(duì)應(yīng)O—H、N—H的伸縮振動(dòng)[26]；在 2 929、2 302 cm-1處的峰對(duì)應(yīng) C—H和 S—H 的伸縮振動(dòng)；在 1 656、1 546、1 382、1 151 cm-1及 1 031 cm-1處的峰對(duì)應(yīng) C O、C C、C—N、C—S及C—O的伸縮振動(dòng)[27]。結(jié)果表明了S-CDs表面—OH、—COOH、—NH2及—SH的存在。由圖1c可知，在285、400、532、164 eV 處有 4 個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)于 C 1s、N 1s、O 1s、S 2p，證明了 S-CDs中 C、N、O 及 S 原子存在[28]。

2.2 底物專(zhuān)一性

不同類(lèi)型的多酚氧化酶具有不同的底物特異性，為了研究生菜PPO的底物專(zhuān)一性，選取了單酚（苯酚）、二酚（鄰苯二酚、間苯二酚、對(duì)苯二酚）、鄰苯三酚為底物，考察其催化活性和速率變化，在相同條件下以對(duì)苯二酚、間苯二酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、苯酚為底物，經(jīng)生菜PPO的催化氧化，在420 nm處測(cè)吸光度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 生菜PPO對(duì)不同酚類(lèi)底物的催化氧化Fig.2 Oxidation of different phenolic substrates under the catalysis of PPO from Lactuca sativa L.

研究結(jié)果表明，生菜多酚氧化酶不具有底物專(zhuān)一性。由圖2a可知，以鄰苯二酚為底物時(shí)產(chǎn)物吸光度最高，這表示在相同催化反應(yīng)時(shí)間下，生菜PPO對(duì)鄰苯二酚的催化速度最快，這可從圖2b的結(jié)果得到證實(shí)。以對(duì)苯二酚和鄰苯三酚作為底物的酶促反應(yīng)催化速率大約只是其速率的一半，而以間苯二酚和苯酚為底物時(shí)其催化氧化活性不明顯。證明以這5種酚類(lèi)為底物，生菜PPO對(duì)鄰苯二酚的親和力和催化活性最高，所以選擇鄰苯二酚作為生菜PPO的主要氧化底物進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 反應(yīng)pH值對(duì)生菜PPO活性的影響

不同pH值條件下測(cè)定的PPO酶活性大小不同，室溫條件下，采用鄰苯二酚為底物測(cè)定不同pH值對(duì)生菜PPO酶活的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH值對(duì)生菜PPO活性的影響Fig.3 Effect of pH value on the PPO activity of Lactuca sativa L.

由圖3可知，酸堿度過(guò)強(qiáng)都會(huì)對(duì)生菜PPO的活性產(chǎn)生明顯的抑制，相對(duì)而言酸性對(duì)其活性的影響較大。當(dāng)pH值為6時(shí)，生菜PPO的活性最強(qiáng)；當(dāng)pH值小于6時(shí)，PPO活性減弱，這可能是因?yàn)镻PO作為一種堿性蛋白質(zhì)，在強(qiáng)酸性條件下會(huì)解離出配基Cu2+，繼而使酶失去活性；當(dāng)pH值大于6時(shí)，PPO的活性隨著pH值的增加而降低，這可能是因?yàn)閴A性條件下，PPO的配基Cu2+會(huì)以氫氧化銅的形式存在而沉淀，使得酶的活性降低[29]。該酶的最適pH值為6，在儲(chǔ)藏過(guò)程中應(yīng)該控制環(huán)境的pH值在4左右來(lái)抑制酶促褐變。

2.4 反應(yīng)溫度對(duì)生菜PPO活性的影響

反應(yīng)溫度對(duì)于PPO活性有一定影響。為了研究生菜PPO的最適反應(yīng)溫度，測(cè)試了不同反應(yīng)溫度下生菜PPO對(duì)鄰苯二酚的催化反應(yīng)程度，結(jié)果如圖4所示。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)生菜PPO活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the PPO activity of Lactuca sativa L.

由圖4可知，隨反應(yīng)溫度的升高，生菜PPO活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。可以看出該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)溫度小于40℃時(shí)，生菜PPO活性隨著反應(yīng)溫度的升高而升高，這是因?yàn)榉磻?yīng)溫度升高加快了反應(yīng)速率；反應(yīng)溫度大于40℃時(shí)，酶活性隨著反應(yīng)溫度的升高而降低，這是因?yàn)楦邷仄茐牧嗣傅慕Y(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其活性部位完整性的損壞，從而使酶失去活性[30-32]。

2.5 抑制劑篩選

3種常用于水果蔬菜保鮮中PPO的抑制劑以及實(shí)驗(yàn)室合成的3種摻雜碳點(diǎn)，對(duì)于生菜PPO活性抑制的效果如圖5所示。

圖5 不同抑制劑對(duì)生菜PPO活性的影響Fig.5 Effect of inhibitor on PPO activity of Lactuca sativa L.

由圖5可知，S-CDs的生菜PPO抑制效果最好，抗壞血酸效果僅次于S-CDs，檸檬酸再次之，Cu-CDs抑制效果較差，而B(niǎo)r-CDs以及半胱氨酸對(duì)生菜PPO活性并無(wú)明顯抑制。這可能是因?yàn)榭箟难峥勺黪倪€原劑，又可以作為銅離子的螯合劑，可將酶絡(luò)合的Cu2+還原為Cu+，從而抑制酶活性[33]；檸檬酸通過(guò)降低反應(yīng)體系的酸堿度來(lái)抑制酶活性[34]；而S-CDs表面的—OH、—SH及—NH2與多酚氧化酶的輔基Cu2+螯合，起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。由圖5b～5d可以看出，在濃度均為0.1 mg/mL時(shí)，在S-CDs作用下生菜PPO的活性只有55%，而抗壞血酸和檸檬酸作用下，其活性分別為57%和78%；當(dāng)濃度到達(dá)0.3 mg/mL時(shí)，而在檸檬酸和抗壞血酸作用下，生菜PPO活性分別還剩下30%和20%，而在S-CDs作用下，生菜PPO活性?xún)H為10%。這些結(jié)果再一次證明S-CDs對(duì)生菜PPO具有較強(qiáng)的抑制效果。

3 結(jié)論

生菜的褐變與生菜PPO的催化活性有著不可分割的關(guān)系，了解PPO的特性旨在更好的控制酶促褐變的發(fā)生。本研究初步考察了不同底物、不同pH值和不同溫度對(duì)PPO活性的影響。研究結(jié)果表明，生菜PPO的主要氧化底物是鄰苯二酚，并且以鄰苯二酚作為底物，得到該酶的最適緩沖液pH值為6，最適溫度為40℃。通過(guò)水熱法合成3種不同摻雜的碳點(diǎn)，與3種常用PPO抑制劑進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：檸檬酸、抗壞血酸、Cu-CDs、S-CDs均能有效抑制生菜PPO活性，其中SCDs及抗壞血酸抑制生菜PPO活性的效果最佳，這可能是由于S-CDs表面含有的還原性—OH、—SH及—NH2對(duì)生菜PPO產(chǎn)生好的抑制效果，這區(qū)別于其他CDs和常規(guī)抑制劑，且當(dāng)S-CDs濃度為0.3 mg/mL時(shí)，生菜PPO已基本失活。