發(fā)酵山楂渣對仔豬生長性能、后腸道菌群和糞便臭味物質(zhì)的影響

■魏秀蓮 韓紹良 婁迎霞 賈勇杰 張景齊 李亞新 陳亞軍 石 徑*

（1.北京市飼料監(jiān)察所，北京 100107；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192；3.北京市平谷區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，北京 101200；4.北京市通州區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，北京 101100；5.北京市大興區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 102600）

隨著我國畜牧業(yè)的高速發(fā)展，針對玉米、大豆等常規(guī)飼料原料出現(xiàn)的人畜爭糧現(xiàn)象越來越緊迫。另一方面，我國水果資源豐富，每年產(chǎn)生大量的果渣，是良好的飼料資源[1-2]。果渣富含糖類、礦物質(zhì)、維生素和膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，還含有黃酮和多酚等活性物質(zhì)，但因水分含量高和營養(yǎng)豐富而不易保存，將果渣合理利用開發(fā)作為飼料，不僅能解決果渣廢棄造成的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，還能緩解我國常規(guī)飼料資源緊缺的問題，降低養(yǎng)殖成本[3-5]。果渣作為一種環(huán)保廉價型的飼料資源，不同果渣具有其特定的營養(yǎng)特點(diǎn)和生物活性成分，在畜牧養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用前景和綜合利用價值[6]。山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）是人們喜愛的一種果品，含有豐富的氨基酸，具有開胃消食、健脾助消化和提升免疫力等功效，山楂產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生大量的山楂渣，開發(fā)為飼料原料具有巨大的潛力[7]。張玲[8]報道，在日糧中添加蘋果渣、山楂渣和梨渣的混合果渣飼料飼喂育肥豬，對育肥豬的采食量、平均日增重和飼料利用率均無不良影響，能夠有效降低飼料成本，提高養(yǎng)豬經(jīng)濟(jì)效益。陳玉河[9]研究發(fā)現(xiàn)在育肥豬飼料中添加山楂渣和蘋果渣后日采食量提高6.3%，平均日增重提高16.98%，60 d的試驗(yàn)期內(nèi)每頭豬增加效益22.35元。

然而，山楂渣中纖維素含量高，并且含有果膠和鞣酸等不易消化的抗?fàn)I養(yǎng)成分，直接飼喂或添加量大會影響動物的營養(yǎng)吸收和生長增重[10]。隨著生物發(fā)酵技術(shù)和加工技術(shù)的發(fā)展，大量研究顯示利用益生菌對果渣飼料原料進(jìn)行發(fā)酵處理，可有效消除大部分抗?fàn)I養(yǎng)因子，具有更高的營養(yǎng)價值和功能活性[11-12]。程玉鑫[13]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵藍(lán)莓果渣具備較高的抗氧化活性并能夠有效改善高脂膳食小鼠的腸道免疫屏障功能。陽林芳等[14]研究報道，在日糧中添加5%～20%發(fā)酵果渣能夠提高育肥豬的屠宰性能和酮體品質(zhì)。發(fā)酵后的果渣飼料營養(yǎng)更加豐富，適口性好，能夠有效提高果渣的飼用價值和飼料轉(zhuǎn)化率，改善動物腸道菌群平衡和生長性能[3，15]。因此，應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)開發(fā)果渣生物飼料對促進(jìn)果渣飼料的推廣具有重要意義，也為綠色環(huán)保、減抗替抗的養(yǎng)殖方案提供了新方向。文章以山楂渣為主要原料，利用菌酶結(jié)合的發(fā)酵工藝制備山楂渣發(fā)酵飼料，并以不同添加方式替代部分仔豬基礎(chǔ)日糧，研究其對仔豬生長性能、養(yǎng)分表觀消化率、后腸道微生物菌群以及糞便臭味物質(zhì)的影響，為開發(fā)果渣發(fā)酵飼料在仔豬養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為減抗替抗的仔豬健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵山楂渣飼料按山楂果渣50%、稻殼粉16%、豆粕5%、發(fā)酵劑（乳酸菌和酵母菌，活菌數(shù)5.0×108CFU/g）2.5%和復(fù)合酶制劑0.5%、水26%的比例混合均勻，30 ℃發(fā)酵4 d。此方法制備的發(fā)酵山楂果渣飼料的水分含量為48%，干物質(zhì)中的營養(yǎng)成分含量為：粗蛋白8.27%、粗脂肪2.60%、粗纖維33.70%、粗灰分9.80%、鈣0.24%、總磷0.15%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計與飼糧

試驗(yàn)在北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司的豬場進(jìn)行，預(yù)試期7 d，正試期33 d。選取體況良好、初始體重相近的三元（杜×長×大）保育后期仔豬160頭，隨機(jī)分為4組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)10頭豬。其中對照組（D組）飼喂基礎(chǔ)飼糧，發(fā)酵山楂渣飼料組（S1、S2組和S3 組）用10%的發(fā)酵山楂渣飼料等量替代基礎(chǔ)飼糧，不同組設(shè)置發(fā)酵山楂渣飼料的不同添加方式，試驗(yàn)分組設(shè)計見表1，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗(yàn)動物分組設(shè)計

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)仔豬飼養(yǎng)于漏縫式地板的欄內(nèi)，每個重復(fù)的豬在同一欄中飼養(yǎng)，每日定點(diǎn)進(jìn)行飼喂，自由采食和飲水。每日定時打掃豬舍兩次，保證日常衛(wèi)生環(huán)境。每日定時對豬舍通風(fēng)換氣，溫度為15～20 ℃。所有試驗(yàn)豬按照豬場日常管理進(jìn)行免疫和驅(qū)蟲，試驗(yàn)期間觀察試驗(yàn)豬的采食量和健康狀況。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長性能

以每個重復(fù)為單位，準(zhǔn)確記錄每日的投料量和剩料量，計算仔豬在飼喂期間的平均日采食量（ADFI）。分別在正式飼喂試驗(yàn)開始和結(jié)束的清晨，稱重并記錄試驗(yàn)仔豬的空腹（12 h）體重，計算平均日增重（ADG）和料重比（F/G）。

1.4.2 養(yǎng)分表觀消化率

正式試驗(yàn)第30～32天采集飼料樣品，采集每個重復(fù)欄剛排出的未被地面污染的新鮮糞便樣品，-20 ℃保存待測。飼糧中粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、干物質(zhì)和磷等養(yǎng)分表觀消化率使用鹽酸不溶灰分（AIA）法測定。

1.4.3 后腸道菌群的測定

飼喂第32天，以重復(fù)為單位，每組隨機(jī)選擇4頭仔豬，采集新鮮無污染糞便，保持冷凍狀態(tài)將糞便樣品送至檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行16S rRNA 的V3～V4 區(qū)域擴(kuò)增、測序及數(shù)據(jù)分析，進(jìn)行后腸道微生物菌群多樣性分析。

1.4.4 糞便臭味物質(zhì)的測定

糞便中揮發(fā)性臭味物質(zhì)的測定采用頂空-氣相色譜法，稱取糞便樣品2 g至10 mL頂空瓶中，80 ℃水浴萃取30 min，將頂空微萃取進(jìn)樣針扎入頂空瓶中繼續(xù)加熱30 min 后上機(jī)。進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量1.0 mL，流速1.0 mL/min，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線280 ℃。根據(jù)全掃描圖中的母離子信息，利用Thermo NIST MS Search 2.3本地數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物質(zhì)鑒定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 軟件進(jìn)行整理，采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），采用Duncan’s法進(jìn)行多組間的差異顯著性分析，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，以P＜0.05為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵山楂渣飼料對仔豬生長性能的影響（見表3）

表3 發(fā)酵山楂渣飼料對仔豬生長性能的影響

由表3可知，各組仔豬的初始體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05），與D 組相比，3 個試驗(yàn)組的末重均有所增加，其中S1 組和S3 組差異顯著（P＜0.05）。與D 組相比，S1、S2 組和S3 組仔豬的平均日增重分別增加了8.36%、1.84%和5.29%，其中S1 組的平均日增重最高且具有顯著性差異（P＜0.05）。與D 組的平均日采食量相比，S2 組和S3 組分別增加了3.32%和8.26%，而S1組的平均日采食量降低了7.87%。S2組和S3組仔豬的料重比與對照組D組無顯著性差異（P＞0.05），S1組料重比與D組相比顯著降低15.04%（P＜0.05）。

2.2 發(fā)酵山楂渣飼料對仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響（見表4）

表4 發(fā)酵山楂渣飼料對仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響（%）

如表4所示，與D組相比，S1組的粗蛋白表觀消化率提高了1.56%，S2組和S3組粗蛋白的表觀消化率分別降低了24.43%和19.72%。S1、S2組和S3組的粗脂肪表觀消化率相比D 組分別降低了10.82%、37.87%和16.53%。對粗纖維的表觀消化率，與D組相比，S1組降低26.09%，S2 組和S3 組分別顯著提高了31.11%和6.59%（P＜0.05）。S1、S2組和S3組的干物質(zhì)、磷和能量的消化率都低于D組，3個試驗(yàn)組中S1組的干物質(zhì)和能量消化率最高，磷的表觀消化率最低（P＜0.05）。

2.3 發(fā)酵山楂渣飼料對仔豬后腸道微生物菌群的影響（見圖1～圖4）

圖1 基于門（Phylum）水平的仔豬后腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

圖4 各組間仔豬后腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的PCA分析

在門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、螺旋體門（Spirochaetes）和變形菌門（Proteobacteria）為仔豬腸后腸道微生物中的優(yōu)勢菌門（見圖1）。與D組相比，S1組仔豬后腸道中厚壁菌門的相對豐度有所降低，S2 組和S3 組后腸道中厚壁菌門的占比增大。S1 組仔豬后腸道中擬桿菌門的相對豐度與D 組無顯著差異，S2 組和S3 組擬桿菌門的占比相比D 組顯著降低（P＜0.05）。S1 組和S2 組螺旋體門的相對豐度相比D組大幅提高，S3組螺旋體門的占比有所降低。3個S組仔豬后腸道中變形菌門的相對豐度相比D組都顯著提高（P＜0.05）。

各組仔豬后腸道微生物共有和特有物種的韋恩圖和花瓣圖分析如圖2所示，與D組相比，S1、S2組和S3組仔豬的后腸道微生物物種數(shù)量（OTU）增加，其中S1組仔豬后腸道微生物種類和特有物種數(shù)量最多，S1組OTU 總數(shù)和特有OTU 數(shù)量相比D 組分別增加17.30%和120.90%，微生物多樣性顯著提升（P＜0.05）。

圖2 仔豬后腸道微生物共有與特有物種（OTU）的韋恩圖（a）和花瓣圖（b）分析

對各組仔豬后腸道在屬水平上的微生物物種豐度進(jìn)行聚類分析（見圖3），圖中縱向?yàn)闃悠烽g的聚類，橫向?yàn)槲⑸镂锓N的聚類，聚類枝越短代表相似性越高。結(jié)果顯示，S1 組與D 組仔豬的后腸道菌群結(jié)構(gòu)最相近，S2組仔豬后腸道菌群結(jié)構(gòu)與D組的差異最大。對各組仔豬后腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的PCA分析結(jié)果顯示（見圖4），同一組別的樣品之間菌群結(jié)構(gòu)具有較高的相似性，能夠明顯地聚類在一起。與對照組D組相比，S1組和S3組與D組仔豬后腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)相似性較高，S2組仔豬后腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)與D組的差異最大。

圖3 基于屬（Genus）水平的各組仔豬后腸道菌群組成豐度聚類圖

2.4 發(fā)酵山楂渣飼料對仔豬糞便臭味物質(zhì)的影響（見表5）

如表5 所示，糞臭素、吲哚和對甲苯酚在仔豬糞便揮發(fā)性臭味物質(zhì)中的占比較大。與D組相比，S1組和S2 組糞臭素含量顯著降低（P＜0.05），分別下降67.55%和38.03%，S3 組糞臭素含量有所升高。S2 組和S3組吲哚含量相比D組顯著下降（P＜0.05），分別降低了42.69%和57.65%，S1 組吲哚含量相比D 組顯著增加（P＜0.05）。S3 組的對甲苯酚含量低于D 組但無顯著性差異（P＞0.05），S1 組和S2 組對甲苯酚含量顯著高于D組（P＜0.05）。相比D組，S1組仔豬糞便中苯酚、乙酸和苯甲醛的含量顯著降低（P＜0.05），S2 組仔豬糞便中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸的含量顯著減少（P＜0.05），S3組的苯酚、乙酸、戊酸和苯甲醛含量顯著降低（P＜0.05）。

表5 發(fā)酵山楂渣飼料對仔豬糞便中臭味物質(zhì)含量的影響(%)

3 討論

3.1 發(fā)酵山楂渣飼料對仔豬生長性能的影響

山楂渣飼料在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量乳酸和特殊的風(fēng)味物質(zhì)，動物進(jìn)食時會促進(jìn)唾液和消化液的分泌，提高適口性，增強(qiáng)食欲。本研究中，發(fā)酵山楂渣飼料代替10%基礎(chǔ)日糧能夠有效提高仔豬的平均日增重，其中發(fā)酵山楂渣飼料與基礎(chǔ)日糧一同制粒后飼喂的添加方式平均日增重最高。發(fā)酵山楂渣飼料單獨(dú)料槽飼喂和與基礎(chǔ)日糧混合后飼喂的添加方式能顯著改善仔豬的食欲，平均日采食量增加，但導(dǎo)致料重比增加。結(jié)果顯示，發(fā)酵山楂渣飼料的最佳添加方式為和基礎(chǔ)日糧一同制粒，與對照組相比顯著降低料重比，提高平均日增重。發(fā)酵山楂渣飼料含有大量益生菌，對腸道健康、提升免疫力和降低腹瀉率具有有益的作用。胡虹等[16]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵飼料可明顯增加仔豬平均日增重和日采食量，降低發(fā)病率，改善腸道微生物菌群。果渣的營養(yǎng)豐富，富含糖類、有機(jī)酸、膳食纖維和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)及多酚和黃酮等活性物質(zhì)，開發(fā)做飼料對飼喂動物的生長發(fā)育有促進(jìn)作用[3]。呂思潼[1]報道將發(fā)酵柑橘渣飼料添加到斷奶仔豬飼料中可提高平均日采食量，降低腹瀉率，降低生產(chǎn)成本；發(fā)酵果渣飼喂成年豬能夠改善豬肉品質(zhì)、促進(jìn)生長、提高免疫力、增加養(yǎng)殖收益。發(fā)酵山楂渣飼料對促進(jìn)豬生長增重、提高飼料利用率和經(jīng)濟(jì)效益都具有很好的效果，這與山楂渣中的酒石酸、枸櫞酸、山楂酸和酶類等活性物質(zhì)成分有關(guān)，這些成分能增加豬自身消化酶的分泌，提高酶活性，發(fā)揮健胃和增重的作用[17]。

3.2 發(fā)酵山楂渣飼料對仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

山楂渣等果渣中粗纖維含量較高，含有鞣酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，即使經(jīng)過發(fā)酵，依舊可能影響?zhàn)B分的消化吸收。鄧銘等[18]發(fā)現(xiàn)用發(fā)酵構(gòu)樹飼料3%、6%和9%的比例替代基礎(chǔ)日糧飼喂斷奶仔豬，粗蛋白、磷和鈣的表觀消化率顯著低于對照組，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵構(gòu)樹飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)成分抵消了有益菌群對養(yǎng)分吸收率的增益作用，導(dǎo)致表觀消化率的下降。本研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵山楂渣飼料代替10%基礎(chǔ)日糧飼喂仔豬，其對養(yǎng)分的表觀消化率有不同程度的降低，但發(fā)酵山楂渣飼料與基礎(chǔ)日糧一同制粒的添加方式中，仔豬對粗蛋白的表觀消化率高于對照組，這與該添加方式組仔豬的平均日增重最大和料重比最低具有一定的相關(guān)性。孫鐵虎等[19]的研究也顯示，日糧中添加發(fā)酵飼料有助于提高育肥豬對飼料中粗蛋白的消化率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵山楂渣飼料替代10%基礎(chǔ)日糧對仔豬的養(yǎng)分消化率無促進(jìn)作用，但仍能顯著提高仔豬的平均日增重，其中發(fā)酵山楂渣飼料與基礎(chǔ)日糧一同制粒的添加方式對仔豬養(yǎng)分消化率的影響程度最小。

3.3 發(fā)酵山楂渣飼料對仔豬后腸道微生物菌群的影響

發(fā)酵飼料富含豐富的乳酸菌及其代謝產(chǎn)物、小分子活性肽、維生素等有益成分，具有酸香氣味，適口性好，飼喂后促進(jìn)有益菌群在腸道中大量定植，抑制有害菌的生長，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。有益菌群進(jìn)一步幫助食物的消化和代謝，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，在提升免疫力、改善動物腸道健康和預(yù)防腹瀉等方面發(fā)揮重要的作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)日糧中添加發(fā)酵山楂渣飼料能夠提升仔豬后腸道的微生物多樣性，調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)。果渣中富含的膳食纖維為腸道微生物提供消耗的底物，促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌的生長，是影響腸道微生物組成的重要因素[21]。新鮮糞便的菌群組成在一定程度上可以反映豬后腸道菌群組成的特征，高印[22]發(fā)現(xiàn)，在早期斷奶仔豬日糧中添加4%～8%發(fā)酵蘋果渣能夠調(diào)節(jié)仔豬腸道的微生態(tài)平衡，降低大腸桿菌數(shù)量和腹瀉率。Kafantaris 等[23]和Wang 等[24]的研究顯示，飼喂青貯葡萄渣顯著增加了仔豬腸道中益生菌和乳酸菌的數(shù)量，降低了腸桿菌和空腸彎曲桿菌等病原菌的數(shù)量，有利于提高斷奶仔豬的抗病能力。

3.4 發(fā)酵山楂渣飼料對仔豬糞便臭味物質(zhì)的影響

豬糞便中的臭味物質(zhì)主要有揮發(fā)性脂肪酸（VFA）、吲哚類、酚類、醛類和硫醇類等，其中對甲苯酚、吲哚和糞臭素是豬糞便臭味物質(zhì)中相對含量較高且不易去除的物質(zhì)，揮發(fā)性脂肪酸與豬糞的臭味強(qiáng)度之間存在相關(guān)性，碳鏈越長其除臭難度越大[25-26]。本研究結(jié)果顯示，發(fā)酵山楂渣飼料代替10%基礎(chǔ)日糧飼喂能夠不同程度地降低豬糞便中臭味物質(zhì)的含量，其中發(fā)酵山楂渣飼料與基礎(chǔ)日糧一同制粒的添加方式降低糞臭素的效果顯著，單獨(dú)料槽飼喂的添加方式對吲哚和所有VFA的降低效果十分顯著，與基礎(chǔ)日糧混合后飼喂的添加方式對吲哚含量有顯著的降低作用。有研究報道降低飼料中粗蛋白水平是減少糞臭源的方法[27-28]，Cho等[29]研究發(fā)現(xiàn)降低豬日糧中粗蛋白的水平到15%能夠降低豬糞中酚類、吲哚類和短鏈脂肪酸等臭味物質(zhì)的含量，這可能與豬腸道菌群的變化及其在蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮的作用有關(guān)。本研究中發(fā)酵山楂渣飼料替代10%基礎(chǔ)日糧降低了飼料的粗蛋白水平，減少營養(yǎng)過剩而消化不完全導(dǎo)致的糞臭。另外發(fā)酵飼料中的益生菌與酶制劑進(jìn)一步改善仔豬的腸道菌群，提高對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，最終改變糞便中揮發(fā)性臭味物質(zhì)的含量[30]。

4 結(jié)論

發(fā)酵山楂渣飼料替代10%基礎(chǔ)日糧能夠顯著改善仔豬的生長性能、提升仔豬后腸道微生物多樣性、降低豬糞便中的揮發(fā)性臭味物質(zhì)。發(fā)酵山楂渣飼料與基礎(chǔ)日糧一同制粒的添加方式效果最佳，對養(yǎng)分消化率影響最小且提高了仔豬對粗蛋白的表觀消化率，顯著提高仔豬平均日增重，降低料重比，有效降低仔豬糞便中糞臭素等臭味物質(zhì)的含量。發(fā)酵山楂渣飼料替代10%基礎(chǔ)日糧在仔豬飼養(yǎng)中具有降低飼養(yǎng)成本、改善豬舍氣味、提高飼喂效果和經(jīng)濟(jì)效益等優(yōu)勢。