抗腫瘤多肽M1-21 的劑型優(yōu)化

譚擁軍，裴超柱，程浩杰，卜會銅，譚桂湘，鄧?yán)?/p>

（湖南大學(xué)生物學(xué)院，湖南長沙 410082）

自1920 年胰島素療法問世以來，多肽藥物以持續(xù)穩(wěn)定的速度進(jìn)入臨床開發(fā)［1］.天然多肽由于較差的化學(xué)和物理穩(wěn)定性以及較短的血漿半衰期，通常不適合直接用于治療，已經(jīng)利用許多化學(xué)的修飾的方法，或增強(qiáng)肽的二級結(jié)構(gòu)（即折疊）來防止被蛋白水解酶降解，從而改善多肽藥物的體內(nèi)半衰期［2-5］.

多肽可自組裝成不同的結(jié)構(gòu)，包括納米管、納米球、納米線和納米纖維［6］.這些有序納米結(jié)構(gòu)的形成與各種分子間非共價相互作用的協(xié)同效應(yīng)有關(guān)，包括氫鍵、π-π 堆積、靜電、疏水和范德華相互作用［7］.自組裝球形肽（NPs）直徑小于100 nm，由于易被細(xì)胞吸收特別適合生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用.NPs 還可以在自組裝過程中將疏水性藥物加載到其內(nèi)核中，從而使其成為藥物遞送系統(tǒng)的理想候選藥物［8-9］.較小的顆粒（<100 nm）避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）立即清除，而較大的顆粒（>250 nm）通過吞噬作用和腎臟的天然過濾系統(tǒng)迅速清除［10］.腫瘤血管系統(tǒng)的高滲透性允許大分子和納米顆粒進(jìn)入腫瘤間質(zhì)空間，這種自發(fā)性積累或“被動”靶向作用被稱為增強(qiáng)的通透性和保留（EPR）效應(yīng)，EPR 效應(yīng)介導(dǎo)的藥物遞送目前被認(rèn)為是將藥物引入腫瘤的有效方法，特別是大分子藥物和載有藥物的藥物納米載體［11-12］.

本課題組篩選出了一種來源于FOXM1 的抗腫瘤多肽M1-21（專利號：CN108440671B），已經(jīng)展現(xiàn)出抗腫瘤效果［13］，具體的藥理機(jī)制已經(jīng)完成正在投稿中.我們通過去溶劑化的方式，使抗腫瘤多肽M1-21 自組裝形成一定大小的納米顆粒，增強(qiáng)了多肽的二級結(jié)構(gòu)，不易被水解酶快速降解，并且Nano-M1-21 可通過EPR 效應(yīng)在腫瘤組織部位富集，更好地發(fā)揮抗腫瘤的效果.

1 材料與方法

1.1 材 料

二氯樹脂、氨基酸購于希施生物科技有限公司，DMF、PIP、DIEA、HBTU、DCM、TFA、EDT、TIS、無水乙醚、乙腈（色譜級）、無水乙醇、甲醇、異丙醇、吡啶等購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，DMEM 培養(yǎng)基購于GIBCO 公司，胎牛血清（FBS）為Hyclone 公司產(chǎn)品，乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、4T1 細(xì)胞購自TACC，臺盼藍(lán)、FITC、BCA 試劑盒購自生工生物工程有限公司，balb/c小鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 設(shè)置程序進(jìn)行多肽M1-21 的合成以及純化、鑒定、標(biāo)記

利用全自動多肽合成儀合成多肽M1-21［圖2（a）］，合成的多肽粗品在蛋白純化儀上使用C18 柱反向?qū)游鲞M(jìn)行純化，流動相分別是水（0.05%TFA）和乙腈（0.05%TFA），乙腈上升洗脫.先對純化出的多肽進(jìn)行質(zhì)譜定性分析，再用高效液相色譜儀對純化的多肽M1-21 進(jìn)行純度檢測，采用C18 柱反向?qū)游鲞M(jìn)行，流動相分別是水（0.05%TFA）和乙腈（0.05%TFA），乙腈上升洗脫，最后軟件積分求出峰面積百分比.用過量摩爾比的FITC 對多肽進(jìn)行標(biāo)記，F(xiàn)ITC 粉末溶于Py∶DMF∶DCM=12∶7∶5 的混合溶液中，再與連有多肽的二氯樹脂混合反應(yīng)6 h，反應(yīng)結(jié)束后用DMF、異丙醇、DCM，先后各洗兩遍，再用切割液將標(biāo)記好的多肽切割下來，用9 倍體積乙醚進(jìn)行沉淀，凍干.

1.2.2 單體M1-21 去溶劑化形成Nano-M1-21 及表征

10 mg 的多肽M1-21 溶于1 mL 的1*PBS 中，取100 μL 于反應(yīng)瓶中，置于磁力加熱攪拌器上（600 r/min，25 ℃）攪拌，以1 mL/min 的流速加入4 倍體積的無水乙醇，持續(xù)攪拌20 min，18 000 g 離心收集沉淀，用PBS 清洗沉淀，去上清，再用PBS 超聲重懸Nano-M1-21.最后用BCA 試劑盒測量Nano-M1-21 的濃度（圖1）.動態(tài)光色散（DLS）儀測量納米顆粒流體動力學(xué)直徑及其分布.取10 μL 乙酸鈾染色的Nano-M1-21 懸浮液滴吸附在碳涂層的300 目銅網(wǎng)上5 min，然后用濾紙除去殘留的液體，干燥，再進(jìn)行TEM 觀察.

圖1 Nano-M1-21的制備Fig.1 Preparation of Nano-M1-21

1.2.3 Nano-M1-21細(xì)胞水平效果驗(yàn)證

將MCF-7、MDA-MB-231、4T1 乳腺癌細(xì)胞鋪到24 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按10 μM、20 μM、30 μM、40 μM、50 μM 的濃度分別加入M1-21、Nano-M1-21，36 h 后去上清加入0.04%的臺盼藍(lán)溶液處理3～5 min，去除臺盼藍(lán)溶液并用PBS 清洗兩遍，顯微鏡下拍照，再進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù).按照上述方法，將FITC 標(biāo)記的M1-21 與未標(biāo)記的多肽按1∶9 的比例混合制備帶熒光的Nano-M1-21，按照前面相同的方法測量濃度以及表征.再按30 μM 的濃度加入到MCF-7，MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中處理2 h，然后觀察熒光判斷M1-21、Nano-M1-21進(jìn)入細(xì)胞的情況.

1.2.4 Nano-M1-21動物水平效果驗(yàn)證

狀態(tài)較好的balb/c 小鼠，年齡達(dá)到6 周后，皮下接種5×105個4T1 乳腺癌細(xì)胞建立皮下實(shí)體瘤模型.3 d 后，M1-21、Nano-M1-21 分別以25 mg/kg 的劑量尾靜脈給藥，隔天給藥一次，并對小鼠體重和腫瘤大小進(jìn)行測量.

2 結(jié)果

2.1 多肽M1-21的合成與鑒定

為了檢測多肽合成的質(zhì)量，我們通過質(zhì)譜分析多肽M1-21［圖2（a）］，質(zhì)譜結(jié)果顯示［圖2（b）］在3560處有明顯峰圖，與M1-21相對分子質(zhì)量一致，說明多肽M1-21 合成成功，并且高效液相色譜檢測純化后的M1-21濃度高達(dá)96.161%［圖2（c）］.

圖2 多肽M1-21的鑒定及純度檢測Fig.2 Identification and purity detection of peptide M1-21

2.2 Nano-M1-21的制備與表征

單體多肽M1-21通過去溶劑化自組裝形成納米顆粒（圖1），TEM和DLS的結(jié)果顯示納米顆粒大小均勻地分布在50 nm 左右［圖3（a）（b）］.體外37 ℃穩(wěn)定性測試（DLS 檢測）可知，24 h 后納米顆粒的大小主要分布在45 nm 左右，48 h 后大小主要分布在27 nm左右，8 d后納米顆粒大小一直維持在27 nm左右［圖3（c）］，說明納米顆粒在37 ℃下具有比較好的穩(wěn)定性，不會完全解聚為單體.

圖3 Nano-M1-21的表征Fig.3 characterization of Nano-M1-21

2.3 細(xì)胞水平上Nano-M1-21能更好地抑制腫瘤細(xì)胞的活力

為了驗(yàn)證Nano-M1-21 的效果，在MDA-MB-231、MCF-7、4T1 乳腺癌細(xì)胞中，將M1-21 和Nano-M1-21按濃度梯度分別加入這三種腫瘤細(xì)胞中，36 h后，用臺盼藍(lán)染色后活細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，Nano-M1-21達(dá)到和M1-21 單體多肽相同的效果所需的量更少.在MDA-MB-231、MCF-7和4T1細(xì)胞中，相對于M1-21，Nano-M1-21 的IC50 分別減少1.53 倍、3.37 倍以及1.5倍（見圖4）.

圖4 Nano-M1-21能更好地抑制腫瘤細(xì)胞的活力Fig4 Nano-M1-21 can better inhibit the activity of tumor cells

2.4 Nano-M1-21更易于被細(xì)胞吸收

按照前面去溶劑的方法，將FITC 標(biāo)記的M1-21和未標(biāo)記的M1-21 按1∶9 混合制備了帶熒光的Nano-M1-21，DLS 和TEM 表征發(fā)現(xiàn)，顆粒大小均勻分布在50 nm 左右［圖5（a）（b）］.在MDA-MB-231、MCF-7 乳腺癌細(xì)胞中，熒光圖［圖5（c）（d）］可知Nano-M1-21更易于被細(xì)胞吸收，可能由于納米化后改變了細(xì)胞對M1-21 的攝取方式，明場細(xì)胞圖發(fā)現(xiàn)Nano-M1-21組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變.

圖5 Nano-M1-21更易于被腫瘤細(xì)胞吸收Fig5 Nano-M1-21 is more easily absorbed by tumor cells

2.5 Nano-M1-21 明顯抑制balb/c 荷瘤小鼠腫瘤的生長

在balb/c小鼠皮下實(shí)體瘤模型中，通過隔天尾靜脈給藥進(jìn)行治療，給藥過程中［圖6（a）］，小鼠體重沒有發(fā)生明顯變化［圖6（b）］，Nano-M1-21比起M1-21單體肽展現(xiàn)出更好的抑瘤效果［圖6（c）］，治療結(jié)束后，將小鼠處死，取出每組皮下瘤觀察大?。蹐D6（d）］并稱量瘤子的質(zhì)量［圖6（e）］，這些結(jié)果都表明，在小鼠腫瘤模型中Nano-M1-21有更好的抑瘤效果.

圖6 Nano-M1-21在小鼠腫瘤模型中有比較好的抑瘤效果Fig6 Nano-M1-21 has a better anti-tumor effect in mouse tumor models

3 討論

肽類藥物給藥后可能受到蛋白水解酶降解或誘導(dǎo)免疫反應(yīng)而受到限制，所以將多肽充分遞送至腫瘤部位是具有挑戰(zhàn)性的［14］.因此，部分肽類藥物需要改進(jìn)其遞送方式以成功開發(fā)出抗癌肽.藥物遞送研究的基本目標(biāo)是通過改善治療分子的遞送來提高治療分子的功效.制劑、控釋、遞送途徑和保存期限的改進(jìn)大大提高了治療效果［15-19］.納米顆粒已被用于改善小分子抗癌藥（例如阿霉素和紫杉醇）的藥代動力學(xué)特性和治療效果［20］.通過這種方式，納米顆粒具有通過增強(qiáng)滲透和保留（EPR）效應(yīng)在腫瘤微環(huán)境中維持藥物暴露的能力［21］.另外，可以用與腫瘤細(xì)胞表面特異性的靶標(biāo)結(jié)合的配體來修飾納米顆粒［22］，從而達(dá)到抗癌藥物靶向腫瘤治療的效果.

因此，我們在具有抗腫瘤效果的多肽M1-21 的基礎(chǔ)上，通過去溶劑化的方式，使單體多肽分子間在疏水力的相互作用下自組裝形成50 nm 左右的多肽納米顆粒.納米化后，細(xì)胞對顆粒物質(zhì)進(jìn)行胞吞，納米顆粒的大小會影響它與細(xì)胞膜的相互作用，并最終影響細(xì)胞內(nèi)吸收，直徑約50 nm 的納米顆粒通常更容易被細(xì)胞吸收［23］，因此M1-21 單體多肽通過納米化后易于被細(xì)胞吸收，改善了多肽對于腫瘤的抑制效果.而自組裝方法可用于治療性肽藥物的劑型改造，以改善其穩(wěn)定性和治療活性，從而開發(fā)無載體的藥物遞送系統(tǒng).在本次研究中，Nano-M1-21 在小鼠腫瘤模型中取得了比較好的抗腫瘤活性，但Nano-M1-21 通過EPR 效應(yīng)在腫瘤部位的富集以及延長其代謝周期還需進(jìn)一步驗(yàn)證.除了通過M1-21本身自組裝形成納米顆粒完成遞送外，還可嘗試其他可自組裝的兩親性材料（脂質(zhì)體等）來完成多肽M1-21 的遞送，這兩種方法往往只是EPR 效應(yīng)的被動靶向.想要取得更好的靶向效果，可以考慮采用主動靶向的策略，在納米粒子表面直接修飾與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的受體定向結(jié)合的配體（iRGD）來靶向腫瘤細(xì)胞.因此，多肽M1-21可嘗試結(jié)合被動靶向和主動靶向的優(yōu)化策略，達(dá)到更好的抑瘤效果.

最后，多肽在自組裝過程中可將疏水性藥物（紫杉醇，阿霉素）載入其疏水內(nèi)核［9］，那么我們的多肽M1-21 成為藥物遞送系統(tǒng)的理想候選藥物的同時也可聯(lián)合其他藥物共同治療腫瘤.一種重組蛋白（四聚體M2e）可通過去溶劑化先形成納米粒子核心，然后在其表面交聯(lián)抗原肽（HA），這種納米顆粒疫苗可誘導(dǎo)持久且強(qiáng)大的免疫力［24］，所以Nano-M1-21可成為有效抗原的載體，進(jìn)入體內(nèi)關(guān)鍵區(qū)域誘導(dǎo)免疫反應(yīng).