熒光PCR法檢測(cè)石蠟標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的流程改進(jìn)

張玲娜，周晶晶，王俏洋，蔡鶯鶯，甘梅富

結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)對(duì)于有肉芽腫性炎特征組織病變的病理診斷具有重要的參考意義。目前，病理科常用的檢測(cè)方法有基于細(xì)菌學(xué)的抗酸染色、金胺O熒光染色，基于分子病理學(xué)的PCR、Xpert MTB/RIF檢測(cè)[1-2]等。其中熒光PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性好、速度快，且價(jià)格實(shí)惠的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于大中型醫(yī)院病理科福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)組織的結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)中[3-6]。由于石蠟組織標(biāo)本中的病菌分布不穩(wěn)定，以及存在核酸的交聯(lián)、降解等因素，熒光PCR法的靈敏度雖然比抗酸染色高，但仍存在一定的假陰性及臨界性的結(jié)果，作者在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)核酸標(biāo)本進(jìn)行濃縮處理再上機(jī)，可以幫助改善上述問題，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2020年～2021年浙江省臺(tái)州醫(yī)院存檔的手術(shù)切除或者活檢，病理診斷為肉芽腫性炎或凝固性壞死的石蠟標(biāo)本364例，其中大標(biāo)本242例，小標(biāo)本122例。

1.2 儀器與試劑CV200真空離心濃縮儀購(gòu)自北京吉艾姆公司，ABI7500熒光PCR儀購(gòu)自ThermoFisher公司。核酸提取試劑(型號(hào)FFPE DNA)購(gòu)自廈門艾德公司，結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)購(gòu)自湖南圣湘公司。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 使用一次性棉簽、刀片、無菌鑷子連續(xù)5 μm厚切片(大標(biāo)本5張，小標(biāo)本10張)置于無菌離心管中，采用核酸提取試劑(按試劑盒說明書操作，其中添加DTB與無水乙醇后，置于56 ℃中加熱1 min再離心)進(jìn)行DNA的提取，最后洗脫體積為40 μL。

1.3.2熒光PCR檢測(cè) 將反應(yīng)液、酶混合液、內(nèi)標(biāo)核酸以38 ∶2 ∶1的比例充分混勻成PCR-混合液，每管40 μL分裝到八聯(lián)管，最后加入5 μL DNA樣本作為PCR反應(yīng)模板上機(jī)檢測(cè)。對(duì)于測(cè)定Ct值<37的樣本，判定為結(jié)核分枝桿菌DNA陽性；37≤Ct值≤39的樣本，為臨界陽性；Ct值>39的樣本，同時(shí)，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)為陽性(Ct值≤40)，判定為結(jié)核分枝桿菌DNA陰性；若內(nèi)標(biāo)Ct值>40或無顯示，則該樣本的檢測(cè)結(jié)果無效，查找并排除原因，并對(duì)此樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3核酸濃縮 將364例標(biāo)本熒光PCR檢測(cè)得到的臨界陽性病例、陰性但有翹尾病例以及曲線異常病例的DNA樣本管(1.5 mL離心管)開蓋置于真空離心濃縮儀中，開啟真空泵、冷阱、濃縮儀1 500 r/min，26 ℃離心濃縮5 min；濃縮結(jié)束后閉上管蓋，混勻離心備用。

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)熒光PCR法檢測(cè)情況364例中檢出陽性150例，臨界陽性7例，陰性207例，其中陰性病例中有13例略有翹尾現(xiàn)象(圖1A)。本實(shí)驗(yàn)將臨界陽性和有翹尾的20例歸為臨界病例。

2.2 改良熒光PCR法檢測(cè)情況臨界病例的核酸用真空離心濃縮儀濃縮5 min之后，再使用熒光PCR法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原7例臨界陽性病例，5例檢出為明確陽性，2例為臨界陽性；原13例陰性病例采用改良法檢測(cè)后，3例檢出為明確陽性，2例為臨界陽性。4例臨界陽性經(jīng)重復(fù)確定為陽性病例。陽性病例中改良檢測(cè)法熒光曲線相對(duì)更明顯，Ct值明顯小于傳統(tǒng)檢測(cè)法，更易于判斷(圖1B)。20例標(biāo)本中，初始核酸濃度最小值17.7 ng/μL，最大值為557.1 ng/μL，平均濃度207.3 ng/μL，所有標(biāo)本的內(nèi)標(biāo)VIC曲線均正常升起。

圖1 傳統(tǒng)和改良熒光PCR檢測(cè)TB DNA擴(kuò)增對(duì)比圖：黃色曲線為陽性對(duì)照，綠色曲線為檢測(cè)樣本：A.傳統(tǒng)熒光PCR法，TB DNA檢測(cè)曲線有翹尾，但是在基線以下；B.改良熒光PCR法，TB DNA曲線CT值為36.8，結(jié)果為陽性

2.3 改良熒光PCR法特異性驗(yàn)證取4例無病變的正常組織，4例檢測(cè)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌核酸強(qiáng)陽性的病例，同一批切片，提取DNA，同時(shí)進(jìn)行濃縮操作，同時(shí)上機(jī)，發(fā)現(xiàn)4例正常組織檢測(cè)結(jié)果全部為陰性，且沒有任何翹尾現(xiàn)象；另外4例仍為強(qiáng)陽性，說明濃縮過程沒有造成交叉污染。

3 討論

隨著越來越多醫(yī)院的檢測(cè)中心尤其是病理科自身建立起規(guī)范的PCR實(shí)驗(yàn)室，熒光PCR檢測(cè)方法以其優(yōu)越的敏感性、特異性、方便性，給結(jié)核分枝桿菌的病理診斷帶來可喜的變革。本組364例標(biāo)本中，93例進(jìn)行了抗酸染色，僅10例陽性，而用熒光PCR法檢測(cè)出了47例陽性。有研究[7]結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)計(jì)算得出，熒光PCR法的靈敏度為71.3%，特異度為99.4%，準(zhǔn)確率為79.1%，其中靈敏度、準(zhǔn)確率遠(yuǎn)高于抗酸染色的41.5%、55.7%，實(shí)驗(yàn)中他們亦發(fā)現(xiàn)有16例隨訪明確為結(jié)核，抗酸染色陽性，熒光PCR法卻未檢測(cè)出陽性，重新分析其中有13例抗酸染色為單個(gè)菌陽性或可疑陽性，部分病例核酸擴(kuò)增曲線有翹尾但未達(dá)到陽性標(biāo)準(zhǔn)。

由于不同石蠟組織標(biāo)本中病菌分布差異較大，以及存在核酸交聯(lián)、降解等不利因素，熒光PCR法仍存在一定比例的假陰性以及臨界的情況。本組改良版核酸濃縮-熒光PCR法通過富集核酸，提高模板量，可有效減少由于組織含菌量太少、穿刺標(biāo)本太少等導(dǎo)致的假陰性結(jié)果(13例臨界標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了5例假陰性)，另一方面也減少了臨界病例數(shù)量。濃縮過程并沒有增加交叉污染的機(jī)會(huì)，且操作簡(jiǎn)便，避免了資源浪費(fèi)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，為結(jié)核特別是不典型結(jié)核病的相關(guān)病理診斷提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。

另外，作者在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)以下幾項(xiàng)注意點(diǎn)：(1)如果提取的核酸濃度過高，不建議繼續(xù)濃縮，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明如果濃縮后的核酸濃度超過1 000 ng/μL，有可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)VIC曲線異常，檢測(cè)結(jié)果不可信；(2)核酸提取試劑的DTL溶液，即裂解液，可能含有SDS等明確會(huì)抑制PCR的強(qiáng)表面活性劑成分，在后續(xù)操作中務(wù)必去除干凈，其中關(guān)鍵環(huán)節(jié)是樣品添加DTB與無水乙醇形成白色沉淀后，建議置于56 ℃金屬浴中加熱1 min等全部透明再離心，否則會(huì)造成最后洗脫的核酸中含有一定抑制劑，再加上濃縮操作后直接影響結(jié)果；(3)核酸洗脫液中一般含有Tris-HCl等離子成分，濃縮過程中可能會(huì)造成體系中離子濃度升高，預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)濃縮至原體積的1/3，內(nèi)標(biāo)VIC曲線仍正常，也可改成稀釋處理的洗脫液或者蒸餾水進(jìn)行洗脫，減少后顧之憂；(4)不濃縮但是降低洗脫液體積也是可選項(xiàng)，但可能會(huì)導(dǎo)致洗脫不充分，降低洗脫率。

本實(shí)驗(yàn)所用的試劑盒是同類型結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑盒中少見的含有內(nèi)標(biāo)的試劑盒，該內(nèi)標(biāo)是指外加的含內(nèi)標(biāo)基因片段的克隆質(zhì)粒，內(nèi)標(biāo)片段長(zhǎng)97 bp，與本組檢測(cè)的目的基因長(zhǎng)度相似(116 bp)，優(yōu)勢(shì)在于可以評(píng)估PCR反應(yīng)是否正常以及是否有效，減少由于PCR反應(yīng)異常導(dǎo)致的假陰性。但本實(shí)驗(yàn)仍有一些不足之處，反應(yīng)體系不包含組織內(nèi)參基因，無法嚴(yán)格反映所提取樣本的質(zhì)量，例如檢測(cè)脫鈣的標(biāo)本結(jié)果陰性，不排除核酸遭到嚴(yán)重破環(huán)從而導(dǎo)致無法檢出的原因。因此，對(duì)于核酸濃度極低或者OD260/280比值異常的病例，需謹(jǐn)慎評(píng)估。