冷凍切片流程中的常見問題及優(yōu)化措施

王 麗，董 巖，陳 蕓

冷凍切片技術(shù)是臨床病理學(xué)診斷中常用的一種技術(shù)方法，其主要原理是在低溫環(huán)境下使組織在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到適合的硬度，隨后進(jìn)行快速切片、染色完成制片工作，進(jìn)而于顯微鏡下觀察切片對(duì)腫瘤性質(zhì)進(jìn)行判定，為臨床醫(yī)師在手術(shù)中確立手術(shù)方案提供強(qiáng)有力的支撐[1]。冷凍切片質(zhì)量直接影響了術(shù)中病理醫(yī)師快速診斷的速度及準(zhǔn)確率，因此，在短時(shí)間內(nèi)完成一張優(yōu)質(zhì)的冷凍切片非常重要。該文根據(jù)2016～2021年云南省腫瘤醫(yī)院病理科使用德國(guó)徠卡CM1950恒冷冷凍切片機(jī)進(jìn)行術(shù)中冷凍制片過程中的一些操作體會(huì)及常見問題進(jìn)行總結(jié)及探討。

1 標(biāo)本接收

當(dāng)病理醫(yī)師接收到冷凍標(biāo)本時(shí)，首先應(yīng)與臨床醫(yī)師核對(duì)患者的基本信息，包括患者姓名、住院科室、住院號(hào)、標(biāo)本取材部位及標(biāo)本名稱等，核對(duì)正確后再進(jìn)行登記，避免差錯(cuò)醫(yī)療事故的發(fā)生。同時(shí)，應(yīng)注意離體時(shí)間太長(zhǎng)的標(biāo)本組織細(xì)胞壞死嚴(yán)重，影響結(jié)果判定，不宜進(jìn)行術(shù)中冷凍，因此行術(shù)中冷凍的標(biāo)本應(yīng)盡量減少中途停留時(shí)間，盡快送檢。

2 取材

(1)取材過程中，取材醫(yī)師需要在短時(shí)間內(nèi)找到該標(biāo)本正確的病變位置。一些樣本病變不明顯或腫塊較小易被遺漏，如甲狀腺微小癌，而有些標(biāo)本需要廣泛取材，如乳腺導(dǎo)管原位癌、甲狀腺腺瘤等，因此需要取材醫(yī)師正確、快速、全面細(xì)致的取材[2]。在取材過程中，杜絕病變組織間的交叉污染，避免誤診的發(fā)生。(2)除正確取材外，送檢行術(shù)中快速冷凍切片的標(biāo)本應(yīng)是新鮮的活體組織，禁止添加任何固定液，亦不能用水清洗，若表面血液或其他液體過多時(shí)可先用濾紙將其表面水分吸干后再進(jìn)行取材，取材的器械需保持干燥，主要是為了防止在速凍過程中組織內(nèi)部出現(xiàn)冰晶空洞，以致組織變形，細(xì)胞增大，嚴(yán)重影響診斷結(jié)果[3]。(3)冷凍取材的大小厚度應(yīng)適宜，一般應(yīng)控制在0.2 cm×1.5 cm×1.5 cm～0.5 cm×1.5 cm×1.5 cm。太大太厚會(huì)造成組織冷凍速度減慢，產(chǎn)生冰晶。太小太薄的組織會(huì)造成切片困難，病變消失，結(jié)果不理想等問題。(4)取材完成后需和取材醫(yī)師核對(duì)病理號(hào)，保證除用于冷凍診斷的其余組織放至對(duì)應(yīng)的包埋盒中，防止標(biāo)本錯(cuò)放的現(xiàn)象發(fā)生。

3 切片、固定及染色

用于冷凍診斷的組織連同對(duì)應(yīng)的條碼一同放在冷凍支撐托上，進(jìn)行快速冷凍，減少組織內(nèi)冰晶的產(chǎn)生。

3.1 組織的冷凍溫度選擇一般冷凍切片機(jī)的溫度以-22～-18 ℃為宜，也可根據(jù)不同的組織類型進(jìn)行不同冷凍溫度的調(diào)節(jié)，云南省腫瘤醫(yī)院病理科接收到的標(biāo)本主要為甲狀腺、肺、乳腺、淋巴結(jié)及子宮標(biāo)本。乳腺、卵巢、肺、子宮等標(biāo)本的冷凍溫度控制在-22～-18 ℃，胃、腸、闌尾等標(biāo)本的冷凍溫度控制在-20～-18 ℃，甲狀腺、肝、腎、脾、淋巴結(jié)、易碎組織等標(biāo)本的冷凍溫度控制在-15 ℃左右，帶少量脂肪組織控制在-25 ℃左右，含大量脂肪或全部為脂肪時(shí)，可考慮先在液氮中迅速冷凍，再放入-30 ℃左右冷凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行切片[4-5]。

3.2 冷凍合格的組織切片(1)采用直接切片法，組織速冷后先進(jìn)行粗修，修至合適的切面進(jìn)行切片，用毛筆將卷曲的組織片刷平后貼起平整的組織切片。切片的完整性對(duì)病理醫(yī)師的診斷十分重要，切片破碎不全、有缺損的原因主要有[6]：①組織脂肪或壞死組織過多；②組織塊冷凍時(shí)間太長(zhǎng)、太硬，切片時(shí)易碎裂不成片；③組織塊邊緣帶有包膜、皮膚、組織過大或冰晶形成，難以切片；④組織過小，無法修到組織的最大切面；⑤切片刀太鈍或較臟、切片出現(xiàn)刀痕，使切片不完整；⑥切片者操作方法不正確，速度快慢不均勻，用力不平衡等使得切片不完整。(2)較小組織制作切片時(shí)，先在支撐托表面放上適當(dāng)OCT進(jìn)行冷凍，等OCT冷凍完成后再將組織塊放于其上進(jìn)行切片，切片時(shí)應(yīng)少修，防止組織病變部位的丟失。(3)切片厚度：原則為細(xì)胞密集且體積小的組織，如淋巴結(jié)，要薄切；纖維多、細(xì)胞稀少且體積大的組織可厚切，如腦組織、脂肪組織。切片完成后組織貼好在載玻片上應(yīng)立即放入冷凍固定液中固定，固定完成后取出切片，待切片上固定液稍干燥后再放入加熱的蘇木精中進(jìn)行染色。

4 染色流程

冷凍切片的染色步驟：加熱蘇木精(1～2 min)→水洗→鹽酸乙醇分化→水洗→溫水藍(lán)化→80%乙醇→醇溶性伊紅(30 s左右)→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇→100%乙醇→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→封片→貼標(biāo)簽。

HE染色的關(guān)鍵在于深淺適度，對(duì)比明顯。染色良好的切片鏡下核質(zhì)對(duì)比清晰，藍(lán)紅相映，核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見(圖1A)，HE染色對(duì)比鮮明，若細(xì)胞核及胞質(zhì)染色對(duì)比較差則增加診斷難度，使準(zhǔn)確率降低(圖1B)。

圖1 冷凍制片鏡下觀察結(jié)果：A.染色良好；B.染色欠佳

5 冷凍制片組織的固定

待診斷醫(yī)師簽發(fā)報(bào)告后，取出冷凍組織，快速溶解OCT，再將組織放入對(duì)應(yīng)病理編號(hào)的包埋盒中(圖2)，此時(shí)應(yīng)當(dāng)注意組織放入包埋盒的正反面是否正確，確保冷凍切片和石蠟HE切片為同一面，放入充足的10%中性福爾馬林中固定，如固定不及時(shí)或固定液量及濃度不足，易造成細(xì)胞蛻變，導(dǎo)致后續(xù)HE染色模糊不清。

圖2 術(shù)中冷凍切片標(biāo)本編號(hào)

6 討論

冷凍制片技術(shù)是術(shù)中快速病理診斷的奠基石，如何在有限的時(shí)間內(nèi)快速有效地完成冷凍制片，不僅是病理診斷的需要，更是術(shù)中臨床醫(yī)師的迫切要求。對(duì)于一些腫瘤體積較小，且患者臨床無明顯癥狀及發(fā)現(xiàn)比較困難的樣本，通過術(shù)中快速冷凍病理診斷可為臨床醫(yī)師手術(shù)方式的選擇提供合理依據(jù)，從而避免對(duì)患者進(jìn)行二次手術(shù)的傷害，具有一定的臨床意義。冷凍標(biāo)本的取材具有一定的局限性，一些腫瘤標(biāo)本體積較大，在有限時(shí)間內(nèi)無法做到完全取材，難以進(jìn)行全面觀察，易造成漏、誤診。為減少及杜絕誤診的發(fā)生，在取材的過程中應(yīng)做到仔細(xì)認(rèn)真核對(duì)標(biāo)本，防止病變部位的丟失和污染，同時(shí)在進(jìn)行冷凍切片時(shí)嚴(yán)格遵守相關(guān)操作流程及質(zhì)量控制，保障切片的質(zhì)量，在實(shí)際的操作中需做到穩(wěn)、準(zhǔn)、快的工作效率，從而使得腫瘤病理診斷結(jié)果準(zhǔn)確、真實(shí)、可靠。

冷凍切片質(zhì)量與常規(guī)石蠟切片質(zhì)量的差別主要是顯微鏡下組織細(xì)胞形態(tài)差別，因此影響冷凍切片的因素主要為組織取材的大小及厚度，組織冷凍切片的時(shí)間及溫度等[7]。冷凍切片的關(guān)鍵是快速冷凍，快速冷凍可減少組織內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，一些取材較大的組織以及含水分較多的組織，常常冷凍速度過慢，易產(chǎn)生冰晶，冰晶一旦形成組織切片內(nèi)會(huì)呈現(xiàn)細(xì)胞變形、條索狀、空泡狀或細(xì)胞增大等現(xiàn)象，從而嚴(yán)重影響術(shù)中快速冷凍病理診斷的結(jié)果[8-9]。冷凍切片比一般石蠟制片要求高、難度大，因此要求病理技術(shù)員在制片的各個(gè)環(huán)節(jié)和對(duì)不同組織成分的特性有充分的認(rèn)識(shí)和掌握，從標(biāo)本的送檢、核對(duì)、取材、冷凍速度、切片溫度及厚度、染色等每一個(gè)環(huán)節(jié)均要認(rèn)真仔細(xì)對(duì)待，只有在工作中不斷摸索、總結(jié)、改進(jìn)和發(fā)現(xiàn)，才能制作出一張良好的冷凍切片。