黏液卡紅復(fù)染在診斷艾滋病合并隱球菌腦膜炎中的應(yīng)用

陳 蓉，張立新，萬利霞，周 虹，阮連國(guó)，張 麗，洪 可

隱球菌腦膜炎(cryptococcal meningitis, CM)是由隱球菌引起的機(jī)會(huì)性感染，與獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)(又稱艾滋病)密切相關(guān)[1]。全球每年因CM死亡的艾滋病患者約18萬，占艾滋病總死亡人數(shù)的15%。我國(guó)屬于艾滋病低流行國(guó)家，由于我國(guó)人口基數(shù)大艾滋病合并CM的患者較多。CM起病隱匿且臨床表現(xiàn)缺乏特異性，早期確診困難，易誤診，導(dǎo)致病死率及致殘率增加[2]。本文探討?zhàn)ひ嚎t復(fù)染法對(duì)艾滋病合并CM的診斷價(jià)值，為細(xì)胞病理學(xué)的微生物診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源收集2016年10月～2019年12月武漢市金銀潭醫(yī)院存檔的128例腦脊液細(xì)胞涂片。選取其中同時(shí)有腦脊液真菌培養(yǎng)及墨汁染色，或隱球菌抗原檢測(cè)結(jié)果的首次送檢病例75例納入研究，其中36例為艾滋病合并CM作為CM組，39例艾滋病無腦膜炎或合并其他腦膜炎作為非CM組。非CM組中無腦膜炎18例，合并結(jié)核性腦膜炎4例，合并病毒性腦膜炎8例，合并神經(jīng)梅毒6例，合并腦梗塞3例。臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中艾滋病及艾滋病毒感染診斷WS293-2019》和2018年5月《中華內(nèi)科雜志》“CM診治專家共識(shí)”。

1.2 方法(1)真菌培養(yǎng)：無菌吸管吸取腦脊液1～2滴滴入肉湯培養(yǎng)48 h，后接種于沙保羅氏瓊脂平板(廣州凱林公司)，放入(35±1) ℃含5%～10%CO2的孵箱中孵育，2天后觀察；同時(shí)吸取1～2滴滴入沙保羅氏斜面培養(yǎng)基孵育1周。有真菌生長(zhǎng)，則行真菌鑒定，任意一種陽性均為陽性。(2)腦脊液墨汁染色：取1滴腦脊液滴于干凈玻片上，滴1滴墨汁(珠海貝索公司)覆蓋腦脊液，蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察，見透亮隱球菌，包括菌體和較寬的莢膜，或菌體出芽判為陽性。(3)隱球菌莢膜抗原檢測(cè)：采用美國(guó)Immuno-Myologics有限公司生產(chǎn)的隱球菌抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金免疫層析法)。(4)黏液卡紅復(fù)染：將已行劉氏染色，并滴加醫(yī)用石蠟油診斷后的腦脊液涂片流水稍洗，75%乙醇30 s脫色，水洗，染色步驟按“黏液卡紅染色液”試劑盒(珠海貝索公司)說明書操作。已復(fù)染的玻片每例由2位病理醫(yī)師分別判讀，作出3種判讀結(jié)果：陰性、陽性、不確定(1～5個(gè)紅色隱球菌)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料36例艾滋病合并CM者，男性34例，女性2例，年齡21～74歲，平均38.8歲。患者以頭痛和(或)頭暈或意識(shí)障礙為最常見癥狀(88.9%，32/36)，其次是發(fā)熱(63.9%，23/36)和嘔吐(27.8%，10/36)；91.7%(33/36)的患者CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)為每微升<100個(gè)，腦脊液壓力≥200 mmH2O占72.2%(26/36)；入院期間死亡或危重放棄治療的患者達(dá)25%(9/36)。

2.2 黏液卡紅復(fù)染鏡下特征腦脊液細(xì)胞涂片脫色后黏液卡紅復(fù)染背景較原劉氏染色背景干凈，隱球菌呈團(tuán)片狀或散在分布，莢膜顯示鮮紅色，其輪廓清楚，呈大小不一的類圓形，可見葫蘆樣出芽，易與具有藍(lán)色細(xì)胞核的淋巴細(xì)胞等其他細(xì)胞鑒別(圖1～3)，病理醫(yī)師易判讀。復(fù)染玻片中紅染的隱球菌或棋盤樣成群，或一大一小相連出芽，或散在單個(gè)。

圖1 A.劉氏染色示隱球菌、淋巴細(xì)胞及雜質(zhì)均著藍(lán)色；B.黏液卡紅復(fù)染后隱球菌紅色，淋巴細(xì)胞藍(lán)色，背景雜質(zhì)不著色 圖2 A.劉氏染色示隱球菌不著色或著淺藍(lán)色，紅細(xì)胞灰色；B.黏液卡紅復(fù)染后隱球菌鮮紅色，紅細(xì)胞淡黃色 圖3 A.黏液卡紅復(fù)染示淋巴細(xì)胞中見一個(gè)紅色的隱球菌；B.黏液卡紅復(fù)染示棋盤樣分布的紅色隱球菌，見出芽，散在3個(gè)藍(lán)色淋巴細(xì)胞

陽性片整片隱球菌數(shù)量不低于10個(gè)，陰性片幾乎無紅色菌體干擾，所檢測(cè)的病例中未出現(xiàn)不確定病例。

2.3 不同染色結(jié)果的一致性分析75例腦脊液細(xì)胞涂片黏液卡紅復(fù)染診斷艾滋病合并CM的敏感性為94.4%(34/36)；特異性為100%(39/39)。腦脊液培養(yǎng)敏感性為77.8%(28/36)，特異性為100%。腦脊液墨汁染色敏感性為11.1%(4/36)，特異性為100%。其中65例同時(shí)有腦脊液隱球菌莢膜抗原檢測(cè)結(jié)果，其敏感性為96.2%(25/26)，特異性為100%(39/39)。腦脊液黏液卡紅復(fù)染同真菌培養(yǎng)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；同隱球菌莢膜抗原檢測(cè)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.90)；同墨汁染色相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005，表1)。

表1 腦脊液黏液卡紅復(fù)染與真菌培養(yǎng)、墨汁染色及隱球菌莢膜抗原檢測(cè)的對(duì)比分析

3 討論

3.1 艾滋病合并CM的臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查CM是由隱球菌感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的炎癥性病變，其臨床癥狀無特異性，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、漸進(jìn)性頭痛、精神和神經(jīng)癥狀，常與其他中樞神經(jīng)感染的癥狀重疊，易誤診[2-3]。與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道相似，本組36例CM中，主訴頭痛和(或)頭暈或意識(shí)障礙的患者最多；CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)每微升<100個(gè)占91.7%，提示對(duì)于CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)每微升<100個(gè)細(xì)胞，出現(xiàn)頭痛、頭暈或嘔吐的艾滋病患者，應(yīng)行腰椎穿刺排除CM[3]。

2010年我國(guó)“隱球菌感染專家共識(shí)”指出，腦脊液墨汁染色、培養(yǎng)和隱球菌莢膜多糖抗原乳膠凝集試驗(yàn)結(jié)果中的任一個(gè)陽性均可確診隱球菌中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染；同時(shí)，患者的臨床癥狀、體征和腦脊液常規(guī)、生化以及影像學(xué)檢查對(duì)診斷具有重要價(jià)值[4]。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)指出，腦脊液墨汁染色可以早期、快速診斷CM，但是診斷的敏感性不一，從首次的44%至多次檢驗(yàn)的100%，常依賴于觀察者的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)水平[2-3]。本組病例中腦脊液墨汁染色的敏感性偏低(11.1%)，回顧性分析發(fā)現(xiàn)該結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室分檢樣本量偏少和檢驗(yàn)者經(jīng)驗(yàn)不足有關(guān)。腦脊液隱球菌培養(yǎng)是確診CM的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，敏感性亦較低，同時(shí)治療過程中培養(yǎng)結(jié)果轉(zhuǎn)陰較為迅速，并不能依此判斷隱球菌已經(jīng)完全喪失活力[2]。本組病例的腦脊液真菌培養(yǎng)敏感性為77.8%，稍高于國(guó)內(nèi)的文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)該與同一樣本雙培養(yǎng)有關(guān)[3]；培養(yǎng)出現(xiàn)7例假陰性，其中5例在外院疑似CM已行抗真菌治療，2例是多次行腦脊液培養(yǎng)后才證實(shí)為CM，提示抗真菌治療后會(huì)影響培養(yǎng)結(jié)果。腦脊液隱球菌莢膜抗原檢測(cè)對(duì)CM的診斷具有較好的敏感性，可用于早期診斷，但存在假陽性反應(yīng)，也不能作為評(píng)估是否治愈的指標(biāo)[3]，受限于病例數(shù)較少和條件限制，基層醫(yī)院多未常規(guī)開展該檢測(cè)。

3.2 腦脊液細(xì)胞涂片黏液卡紅復(fù)染的病理學(xué)診斷隱球菌在體外為無莢膜或僅有小莢膜，進(jìn)入人體內(nèi)后很快形成厚莢膜，具有莢膜的隱球菌菌體增大，致病力明顯增強(qiáng)[4]。黏液卡紅染色是傳統(tǒng)的組織病理特殊染色方法，操作簡(jiǎn)單，原理是卡紅與媒染劑鋁形成螯合物，其分子帶正電荷能與低密度的酸基質(zhì)如黏液類物質(zhì)結(jié)合呈紅色。隱球菌的莢膜屬于黏液物質(zhì)，能被卡紅染成紅色，陽性即可確診，其他真菌無黏多糖莢膜，所以黏液卡紅染色對(duì)隱球菌診斷具有特征性[5]。

腦脊液細(xì)胞涂片黏液卡紅復(fù)染后，玻片背景較原劉氏染色干凈，淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)不著色或淡灰色，紅細(xì)胞呈淡灰色或淡黃色；隱球菌莢膜顯示鮮紅色，類圓形，輪廓清楚。涂片中隱球菌數(shù)量多時(shí)，呈棋盤樣成群成片分布，菌體大小不一，可見典型一大一小葫蘆樣出芽；數(shù)量偏少時(shí)，隱球菌三五成群或散在單個(gè)分布，大者比淋巴細(xì)胞大，小的不及中性粒細(xì)胞的單個(gè)分頁核。

復(fù)染后隱球菌易與腦脊液中的人體細(xì)胞及其他微生物鑒別。病理醫(yī)師易判讀，陽性片滿視野可見紅色菌體，部落樣成群分布，數(shù)量大；陰性片幾乎無紅色顆粒，紅細(xì)胞呈類圓形，著淡灰色或黃色，需注意鑒別；當(dāng)全片出現(xiàn)少數(shù)散在紅色菌體樣顆粒，無典型出芽菌體時(shí)，需謹(jǐn)慎判讀，以防止污染后出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

3.3 黏液卡紅復(fù)染診斷CM的可信度和優(yōu)勢(shì)本組數(shù)據(jù)顯示，黏液卡紅復(fù)染診斷艾滋病合并CM具有較高的敏感性(94.4%)和特異性(100%)；其敏感性稍高于真菌培養(yǎng)，特異性同真菌培養(yǎng)和隱球菌莢膜抗原檢測(cè)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的墨汁染色。

臨床診斷性抽取腦脊液樣本量少，送檢病理科的樣本僅能離心制片1張滿足常規(guī)細(xì)胞病理診斷，黏液卡紅復(fù)染利用已完成的細(xì)胞病理診斷涂片，不增加樣本或再次送檢，實(shí)現(xiàn)病理學(xué)對(duì)隱球菌腦膜炎的微生物診斷。當(dāng)臨床初診為其他腦炎，未送檢隱球菌實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢驗(yàn)，或其他原因未實(shí)現(xiàn)CM的診斷時(shí)，細(xì)胞病理黏液卡紅復(fù)染可實(shí)現(xiàn)隱球菌微生物學(xué)補(bǔ)救性診斷。

綜上所述，艾滋病合并CM起病隱匿，臨床表現(xiàn)無特異性，基層醫(yī)院條件受限，及時(shí)診斷存在一定的困難[2]，腦脊液細(xì)胞涂片黏液卡紅復(fù)染可實(shí)現(xiàn)CM微生物學(xué)診斷，適合推廣應(yīng)用。值得注意的是，臨床的早期判斷和腰椎穿刺、組織病理學(xué)、影像學(xué)、藥物觀察等多學(xué)科合作可使患者最大程度的獲益。