水質(zhì)生物毒性測(cè)量中藻類(lèi)光合熒光參數(shù)與初始生物量的關(guān)系

陳敏，殷高方，趙南京，甘婷婷，谷夢(mèng)園，亓培龍，丁志超，王璐，馮春，張小玲

（1 中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所，中國(guó)科學(xué)院環(huán)境光學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031）

（2 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，合肥 230026）

（3 安徽省環(huán)境光學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031）

（4 安徽大學(xué)，合肥 230039）

0 引言

微藻作為水生環(huán)境的初級(jí)生產(chǎn)者，個(gè)體小、繁殖快，對(duì)毒性反應(yīng)敏感，是評(píng)價(jià)污染化學(xué)品生物毒性極其重要的工具［1-2］。但廣泛使用的藻類(lèi)生物測(cè)試指南，“淡水藻類(lèi)和藍(lán)細(xì)菌，生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)”（OECD 201）規(guī)定的指數(shù)生長(zhǎng)測(cè)試至少需要72 h［3］，無(wú)法滿(mǎn)足水質(zhì)安全預(yù)警和污染物應(yīng)急監(jiān)測(cè)的需求。

熒光動(dòng)力學(xué)方法作為一種非破壞性、非侵入性的技術(shù)，可在幾分鐘內(nèi)獲悉光合系統(tǒng)狀態(tài)［4］，在實(shí)時(shí)檢測(cè)和水安全應(yīng)用方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值［5］。該技術(shù)提供了藻類(lèi)光合活性的直接信息，早期在除草劑（光合抑制劑）上進(jìn)行了大量的研究［6］，現(xiàn)在也被用于測(cè)試其他化學(xué)品的毒性，如重金屬［7-8］、多環(huán)芳烴［9］等。

通過(guò)監(jiān)測(cè)藻類(lèi)熒光動(dòng)力學(xué)變化過(guò)程可獲取與光合系統(tǒng)密切相關(guān)的一系列光合熒光參數(shù)。這些參數(shù)對(duì)應(yīng)著光合作用電子輸運(yùn)流的不同過(guò)程，快速反映有毒物質(zhì)對(duì)光合系統(tǒng)的影響，是理想的生物毒性測(cè)試終點(diǎn)。目前基于這些參數(shù)的毒性數(shù)據(jù)也非常多，但由于毒性測(cè)試方案的不同，導(dǎo)致產(chǎn)生的毒性數(shù)據(jù)有較大差異［10］。因此，有必要進(jìn)行相關(guān)測(cè)試條件的分析，減少實(shí)驗(yàn)室間的可變性［11-12］。在生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中，因?yàn)樾枰锪康姆e累，每個(gè)細(xì)胞的毒物可用性取決于毒物的初始濃度和細(xì)胞密度，初始生物量會(huì)顯著影響藻類(lèi)毒性試驗(yàn)的結(jié)果，所以“淡水藻類(lèi)和藍(lán)細(xì)菌，生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)”（OECD 201）中對(duì)初始微藻生物量有明確要求。SINGH P K 等也推薦使用較低生物量的藻樣來(lái)進(jìn)行藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制毒性測(cè)試［13］。然而，這一結(jié)論在以光合熒光參數(shù)作為毒性測(cè)試終點(diǎn)時(shí)是否適用，至今無(wú)相關(guān)研究或可靠數(shù)據(jù)可證明。熒光動(dòng)力學(xué)技術(shù)本質(zhì)上是采用光學(xué)探測(cè)器來(lái)監(jiān)測(cè)微藻體內(nèi)的葉綠素?zé)晒庑盘?hào)變化，所以本文以葉綠素濃度作為生物量的衡量，以蛋白核小球藻作為受試對(duì)象，分析在敵草隆短期暴露下，作為毒性測(cè)試終點(diǎn)的光合熒光參數(shù)與初始生物量的關(guān)系，為基于光合熒光參數(shù)的生物毒性快速檢測(cè)方法建立提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)與溶液配制

蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa，F(xiàn)ACHB-5）為中國(guó)淡水水域的一種常見(jiàn)綠藻，具有分散均勻、不易粘壁的特性。因此本研究以蛋白核小球藻為受試藻種，采購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)。該藻種培養(yǎng)在恒溫?fù)u床（MQD-S3R）中進(jìn)行，光源為白色冷熒光燈管，培養(yǎng)條件為：溫度25±1 ℃、轉(zhuǎn)速120 r·min-1、光照強(qiáng)度120 μmol·m-2·s-1、光暗比12 h∶12 h。待藻液培養(yǎng)2～3 天，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以其開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究。

采用藻類(lèi)分析儀（FluoroProbe，德國(guó)BBE公司）對(duì)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的蛋白核小球藻進(jìn)行葉綠素濃度（生物量）測(cè)量，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要以滅菌后的BGII培養(yǎng)基對(duì)藻液進(jìn)行稀釋?zhuān)@取一系列不同生物量的藻液，以開(kāi)展不同生物量蛋白核小球藻對(duì)敵草?。?-（3，4-dichlorophenyl）-1，1-dimethylurea，DCMU）響應(yīng)研究。由于脅迫物質(zhì)敵草?。―CMU，阿拉?。ㄖ袊?guó)上海），純度99%）在水中溶解度很低，因此使用二甲基亞砜（DMSO，阿拉?。ㄖ袊?guó)上海），純度＞99%）作為溶劑配制DCMU 脅迫下蛋白核小球藻的待測(cè)樣品，最終單個(gè)樣品體積為50 mL，DCMU的濃度分別為0、1、2、5、10、20、40 μg·L-1（樣品中DMSO 含量小于0.1%），所有樣品以同樣方式制得3份。

1.2 光合熒光參數(shù)獲取

采用ACT2＆FastOcean FRR 藻類(lèi)熒光系統(tǒng)（英國(guó)CTG 公司）對(duì)DCMU 脅迫下不同蛋白核小球藻的待測(cè)樣品進(jìn)行光合熒光參數(shù)測(cè)量，以分析DCMU 對(duì)不同初始生物量蛋白核小球藻光合熒光參數(shù)的影響。該系統(tǒng)由FastOcean 快速重復(fù)率熒光儀和ACT2 實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)組成。測(cè)量過(guò)程中，激發(fā)光源選擇450 nm 的LED，光化光設(shè)置從0 到800 μmol·m-2·s-1共8 個(gè)光強(qiáng)值，獲取待測(cè)樣品的快速光曲線(xiàn)（Fast Light Curve，F(xiàn)LC），并得到如表1 所示的11 個(gè)光合熒光參數(shù)，單個(gè)樣品測(cè)量周期約為3 min。

表1 由FRRf 獲取的光合熒光參數(shù)［14］Table 1 Photosynthetic fluorescence parameters obtained from FRRf［14］

2 結(jié)果與討論

2.1 初始生物量變化時(shí)不同光合熒光參數(shù)毒性響應(yīng)分析

圖1（a）和圖1（b）為10 μg·L-1DCMU 短期脅迫下（1 h 和3 h），不同初始生物量樣品對(duì)應(yīng)光合熒光參數(shù)的毒性響應(yīng)情況，以處理組與空白組的比值（球型）表示。其中灰色實(shí)線(xiàn)（100%）表示空白組，球型分布于實(shí)線(xiàn)上方，表明該參數(shù)受到促進(jìn)作用；球型分布于實(shí)線(xiàn)下方，表明該參數(shù)受到抑制作用。柱形指示的是不同光合熒光參數(shù)在初始生物量變化情況下獲得毒性測(cè)試數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。

圖1 短期脅迫下，不同初始葉綠素濃度對(duì)應(yīng)的11 個(gè)光合熒光參數(shù)對(duì)10 μg·L-1 DCMU 的毒性響應(yīng)情況Fig.1 Under short-term stress，the toxic response of 11 photosynthetic fluorescence parameters corresponding to different initial chlorophyll concentrations to 10 ug·L-1 DCMU

由圖1 可知，參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ以及τes的毒性測(cè)試結(jié)果基本不隨蛋白核小球藻初始生物量的變化而變化，當(dāng)葉綠素濃度在20～1 000 μg·L-1的區(qū)間內(nèi)變化時(shí)，10 μg·L-1DCMU 脅迫1 h 與3 h 時(shí)該六個(gè)參數(shù)測(cè)試結(jié)果對(duì)應(yīng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均低于5%，對(duì)應(yīng)平均值分別為2.74%與3.12%；而參數(shù)Ek、F0、Fm、Fv和JVPⅡ，其測(cè)試結(jié)果則明顯受到初始生物量的影響，當(dāng)葉綠素濃度在20～1 000 μg·L-1區(qū)間內(nèi)變化時(shí)，DCMU 脅迫1 h 與3 h 時(shí)五個(gè)參數(shù)測(cè)試結(jié)果對(duì)應(yīng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均高于10%，對(duì)應(yīng)平均值分別為14.66%與17.27%。以上結(jié)果表明，當(dāng)葉綠素濃度在20～1 000 μg·L-1的區(qū)間內(nèi)變化時(shí)，短期脅迫下，光合熒光參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ以及τes對(duì)DCMU 的毒性測(cè)試結(jié)果更為穩(wěn)定，不受測(cè)試樣品初始生物量的影響。

2.2 光合熒光參數(shù)與生物量的相關(guān)性分析

為充分了解光合熒光參數(shù)與生物量（葉綠素濃度）的關(guān)系，分析參數(shù)與生物量的相關(guān)性是否對(duì)毒性響應(yīng)穩(wěn)定性造成影響，進(jìn)一步測(cè)試了當(dāng)?shù)鞍缀诵∏蛟迦~綠素濃度在20～1 000 μg·L-1的區(qū)間內(nèi)變化時(shí)，未受脅迫狀態(tài)下蛋白核小球藻11 個(gè)光合熒光參數(shù)數(shù)值隨葉綠素濃度變化的規(guī)律，并分別計(jì)算了同一光合熒光參數(shù)在不同藻生物量下的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果如圖2。

由圖2 可知，11 個(gè)光合熒光參數(shù)可分為兩類(lèi)，第一類(lèi)為Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ和τes，其數(shù)值基本不隨葉綠素濃度的變化而變化，當(dāng)葉綠素濃度在20～1 000 μg·L-1范圍變動(dòng)時(shí)，F(xiàn)v/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ和τes測(cè)得數(shù)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 分別為3.00%，3.66%，3.80%，3.67%，0.09%和7.74%，具有很好的一致性，說(shuō)明這類(lèi)參數(shù)只表征蛋白核小球藻的光合信息，與藻類(lèi)生物量變化不相關(guān)。第二類(lèi)參數(shù)為Ek、F0、Fm、Fv以及JVPⅡ，這些參數(shù)隨葉綠素濃度變化表現(xiàn)出一定的變化趨勢(shì)，其數(shù)值受生物量影響，其中Ek 與葉綠素濃度呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)0、Fm、Fv以及JVPⅡ與葉綠素濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，說(shuō)明這些參數(shù)的數(shù)值變化除了包含光合系統(tǒng)信息，也反映了一定的生物量信息。結(jié)合2.1 節(jié)所得結(jié)論，可知當(dāng)初始生物量發(fā)生變化時(shí)，光合熒光參數(shù)與生物量的相關(guān)性會(huì)影響毒性測(cè)試結(jié)果的穩(wěn)定，與生物量無(wú)關(guān)的第一類(lèi)參數(shù)獲取的毒性測(cè)試結(jié)果更穩(wěn)定。

圖2 11 個(gè)光合熒光參數(shù)數(shù)值隨葉綠素濃度的變化趨勢(shì)Fig.2 The trend of 11 photosynthetic fluorescence parameters with chlorophyll concentration

2.3 不同初始生物量對(duì)應(yīng)光合熒光參數(shù)的毒性劑量效應(yīng)分析

穩(wěn)定敏感的毒性劑量效應(yīng)分析是水質(zhì)生物毒性測(cè)量的關(guān)鍵。由于涉及參數(shù)眾多，為篩選出能與毒物建立良好劑量效應(yīng)的參數(shù)，并針對(duì)該參數(shù)提出最佳的初始生物量區(qū)間，本研究以處理組與空白組的比值作為縱坐標(biāo)，DCMU 的濃度為橫坐標(biāo)，利用Logistic 函數(shù)建立了不同初始生物量對(duì)應(yīng)光合熒光參數(shù)的劑量效應(yīng)曲線(xiàn)，得到了對(duì)應(yīng)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)R2以及毒性數(shù)據(jù)EC20（產(chǎn)生20%效應(yīng)對(duì)應(yīng)的毒物濃度）、EC50（產(chǎn)生50%效應(yīng)對(duì)應(yīng)的毒物濃度），如表2。并以參數(shù)Fv/Fm、Fm為例，展示了DCMU 脅迫下，參數(shù)Fv/Fm、Fm及對(duì)應(yīng)的毒性數(shù)據(jù)EC20隨測(cè)試樣品初始生物量的變化趨勢(shì)，如圖3。

表2 不同初始生物量下光合熒光參數(shù)獲得DCMU 相關(guān)毒性數(shù)據(jù)（μg·L-1）及劑量效應(yīng)曲線(xiàn)擬合相關(guān)系數(shù)R2Table 2 DCMU-related toxicity data（μg·L-1）and dose-effect curve fitting effect（R2）obtained by photosynthetic fluorescence parameters under different initial biomass

由表2 可知，在DCMU 脅迫下，第一類(lèi)參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes均呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系（R2＞0.9），第二類(lèi)參數(shù)中只有F0、Fm以及Fv呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系（R2＞0.9）。以EC50、EC20以及R2作為主要的分析參考依據(jù)（R2＞0.9，EC50和EC20數(shù)值較低），給出了當(dāng)以參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes、F0、Fm以及Fv作為DCMU 毒性測(cè)試終點(diǎn)時(shí)測(cè)試樣品初始生物量的最佳范圍。對(duì)第一類(lèi)參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes，最佳的藻類(lèi)初始葉綠素濃度（生物量）范圍為10～2 000 μg·L-1，在此范圍內(nèi)所獲取的毒性數(shù)據(jù)EC20、EC50數(shù)值低且穩(wěn)定，符合2.1 節(jié)所述結(jié)論，但是當(dāng)初始葉綠素濃度為4 μg·L-1時(shí)，EC50與EC20明顯偏高，分析原因是由于藻種具有群體依賴(lài)性［15］，過(guò)低的生物量會(huì)影響藻種的光合生理狀態(tài)，本研究中也確實(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)葉綠素濃度降到4 μg·L-1，藻光合活性Fv/Fm發(fā)生了突降（圖3（a））。對(duì)第二類(lèi)參數(shù)F0、Fm與Fv，最佳的藻類(lèi)初始葉綠素濃度（生物量）范圍為200～1 000 μg·L-1，在此范圍內(nèi)所獲取的毒性數(shù)據(jù)EC20、EC50數(shù)值低且穩(wěn)定。此外，當(dāng)初始葉綠素濃度為2 000 μg·L-1，劑量效應(yīng)曲線(xiàn)的擬合效果較差；當(dāng)初始葉綠素濃度在4～100 μg·L-1范圍內(nèi)時(shí)，葉綠素濃度越低，EC50與EC20越高。

圖3 參數(shù)數(shù)值及對(duì)應(yīng)DCMU 毒性數(shù)據(jù)EC20隨初始葉綠素濃度的變化趨勢(shì)Fig.3 The value of the parameter and the corresponding DCMU toxicity data EC20 change trend with the initial chlorophyll concentration

3 結(jié)論

本文以蛋白核小球藻為受試生物，研究了DCMU 短期脅迫下，作為毒性測(cè)試終點(diǎn)的光合熒光參數(shù)（Fv/Fm，Yield，α，rP，σPSⅡ，τes，Ek，F(xiàn)0，F(xiàn)m，F(xiàn)v，JVPⅡ）與初始生物量的關(guān)系。結(jié)果表明，當(dāng)初始生物量發(fā)生變化時(shí)，光合熒光參數(shù)與生物量的相關(guān)性會(huì)直接影響到毒性測(cè)試結(jié)果的穩(wěn)定性，可將光合熒光參數(shù)分為兩類(lèi)，第一類(lèi)為Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ和τes，其數(shù)值與生物量變化不相關(guān)，只表征蛋白核小球藻的光合系統(tǒng)信息，該類(lèi)參數(shù)獲取的毒性測(cè)試結(jié)果不受初始生物量變化的影響，當(dāng)初始葉綠素濃度在20～1 000 μg·L-1的區(qū)間內(nèi)變化時(shí)，10 μg·L-1DCMU 脅迫1 h 與3 h 時(shí)該六個(gè)參數(shù)測(cè)試結(jié)果對(duì)應(yīng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值分別為2.74%與3.12%；第二類(lèi)參數(shù)為Ek、F0、Fm、Fv以及JVPⅡ，其數(shù)值受生物量影響，包含生物量信息，這類(lèi)參數(shù)的毒性測(cè)試結(jié)果明顯受到生物量波動(dòng)的影響，穩(wěn)定性變差，當(dāng)葉綠素濃度在20～1 000 μg·L-1區(qū)間內(nèi)變化時(shí)，10 μg·L-1DCMU 脅迫1 h 與3 h 時(shí)五個(gè)參數(shù)測(cè)試結(jié)果對(duì)應(yīng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值分別為14.66%與17.27%。進(jìn)一步的劑量效應(yīng)分析結(jié)果表明，參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes、F0、Fm以及Fv在DCMU 脅迫下呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。另外根據(jù)EC50、EC20以及相關(guān)系數(shù)R2，給出了不同光合熒光參數(shù)作為毒性測(cè)試終點(diǎn)時(shí)，藻類(lèi)初始葉綠素濃度的最佳范圍：對(duì)參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes，建議范圍為10～2 000 μg·L-1；對(duì)于參數(shù)F0、Fm與Fv，建議范圍為200～1 000 μg·L-1。該結(jié)果為基于光合熒光參數(shù)的生物毒性快速檢測(cè)方法的建立提供了重要依據(jù)。