法薏仁對鹽水負荷模型大鼠的利尿作用研究

羅黎明，李龍雪，舒 坤，肖素云，吳鐘睿，洪 滔，劉志勇

(江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心，330004，南昌)

0 引言

一些對水代謝或血液循環(huán)有益的中藥通常具有利尿作用，同時加工技術的不同會使這些中藥可能具有不同靶點甚至多靶點的利尿作用[1]，由于傳統(tǒng)利尿西藥有一定的副作用，因此，尋找具有利尿作用的中草藥成為越來越受歡迎的研究方向[2-4]。薏苡仁是國內非常受歡迎的藥食兩用物質，它具有良好的除濕作用，用作治療濕證相關疾病的藥物，法薏仁是根據(jù)中藥炮制理論，將薏苡仁經浸、蒸、炒等多種炮制方法組合加工而成的薏苡仁的炮制品，它的藥性由涼轉平，對健脾利濕有很好的保健作用[5-6]。 薏苡仁及其粗提物的藥理特性以前已有研究，然而，在正常條件下，薏苡仁，尤其是法薏仁的利尿活性和利尿機制，尚未在正常大鼠中進行系統(tǒng)研究。因此，迫切需要弄清兩者的利尿活性和利尿機制的區(qū)別，以期為臨床用藥提供指導。本研究的目的是評估薏苡仁及其新炮制品法薏仁在7 d內對正常大鼠的利尿活性，通過給藥后不同時間點(1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h、110 h、134 h和158 h)測量尿量、尿電解質濃度(Na+、K+、Ca2+、Cl-)和pH值，檢測尿中Na+-K+ATPase、心房肽素(ANP)、抗利尿激素(ADH)、醛固酮(ALD)以及AQPs水平。

1 材料

1.1 儀器

大鼠代謝籠(山東新華實驗動物設備有限公司)；全波長酶標儀(美國Thermo公司)；PH S-3C型精密pH計(上海雷磁儀器廠)；尿液離子檢測Beckman couler AU2700(美國)。

1.2 藥品與試劑

生薏苡仁粉，法薏仁粉，均由江西景德中藥有限公司提供；呋塞米片(上海朝暉制藥公司，批號：20191021)；戊巴比妥鈉(德國默克公司，批號：K2208)；大鼠ADH抗利尿激素酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號：20190513)、大鼠ALD醛固酮試劑盒(批號：20191027)、大鼠ANP心房鈉尿肽ELISA試劑盒(批號：20190922)均購自上海赫澎生物科技有限公司。

1.3 受試動物

雄性無特定病原體級SD大鼠，體重范圍為180～220 g，由江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心提供，生產許可證號：SCXK(贛)2018―0003。在江西中醫(yī)藥大學屏障實驗系統(tǒng)內組織實施，系統(tǒng)使用許可為SYXK(贛)2017―0004。所有動物操作符合實驗動物倫理要求,并獲得江西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的審批。

2 方法

2.1 試驗模型制備與給藥安排

大鼠先行1W的檢疫，檢疫合格后按下述方法進行水負荷篩選：每只大鼠按2.5 mL/100g灌蒸餾水，留置2 h的尿量，尿量大于給水量40%的實驗鼠判為模型復制成功。將水負荷模型復制成功的40只大鼠，按體重、尿量隨機分為生理鹽水模型組、呋塞米陽性對照組(20 mg/kg)、生薏苡仁組(1 000 mg/kg)、法薏仁高(1 000 mg/kg)、法薏仁低劑量組(500 mg/kg)每組8只。實驗前夜停止喂食16 h，不禁水，次日實驗時各組大鼠按4 mL/100g給予1%NaCL溶液，制備鹽水負荷模型。模型復制成功20 min后，按1 mL/100g口服給予相應劑量的藥物。

2.2 指標檢測

各組大鼠給藥后，立即放入代謝籠中，每1 h、2 h、3 h、4 h、6 h收集1次尿液，共計5次，測量各時間點的尿量，檢測各組大鼠各時間點尿液的pH和鈉氯鉀鈣的量，計算離子濃度。尿液收集完成后以3%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，搜集血樣，3 000 r/min(離心半徑：6 cm)進行10 min離心，獲取上層血清對照ELISA試劑盒說明書進行操作，測定各組大鼠血清樣本中醛固酮、心房鈉尿肽等的含量，處死大鼠后，取出腎臟和脾，剪取腎髓質和脾，各置1.5 mL離心管中-80 ℃凍存待檢AQP1,2,3基因表達水平。

2.3 AQP1,2,3基因的表達

2.3.1 RNA 抽取和反轉錄 使用RNA extraction kit 抽提RNA后，使用逆轉錄試劑盒反轉錄RNA獲得cDNA存于-80 ℃冰箱。

2.3.2 熒光定量 PCR引物的設計和實時PCR 引物序列和PCR擴增反應參照文獻[7]，內參基因選擇 GAPDH。引物序列和反應體系見表1和表2。

混合后實驗體系置于熒光定量PCR儀中反應， 擴增反應條件如下： 95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)；然后反應體系由50 ℃到90 ℃ (每6 s增加1 ℃)；收集參考基因和目的基因的Ct值； 最后計算目的基因的相對表達水平，并按照Yang et al[8]實驗方法對數(shù)據(jù)進行處理。

表1 RT-qPCR 的引物序列

表2 PCR反應體系

2.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，通過SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行處理，選擇單因素方差分析(One way ANVOA)及LSD比較，結果中P<0.05表示經統(tǒng)計學運算，差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 實驗大鼠尿液量的變化

給藥后1 h和2 h生薏苡仁和法薏仁低、高劑量組和陽性對照組大鼠的尿量與模型組比較有所增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且陽性對照組利尿效果最明顯；給藥后3 h法薏苡仁各劑量組大鼠尿量較生薏苡仁和陽性組多，差異達到顯著水平(P<0.05)；但在給藥后4 h和6 h后，各實驗組尿量減少，但高劑量法薏仁和生薏苡仁尿量與陽性組相當，差異不具有統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)。這表明薏苡仁不管是炮制前還是炮制后作用與呋塞米差不多。之后的每24 h的尿量，各實驗組和陽性組尿量均高于模型組，法薏仁高劑量的利尿作用在48 h、110 h、134 h時高于陽性對照組，生薏苡仁的利尿作用基本與法薏仁低劑量相當。各組大鼠各時間點的尿量比較見圖1，各組大鼠的總尿量比較見圖1。

注：與模型組比較，*P<0.05

由圖1可知，與模型組比較，薏苡仁經過炮制后法薏仁的利尿作用和呋塞米相當，并且與對照組大鼠比較差異具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而炮制前的生薏苡仁雖然也具有利尿作用，但基本與法薏仁的低劑量的利尿作用相當，表明炮制后的薏苡仁利尿作用較強。

3.2 實驗大鼠尿液pH酸堿度和Na+、K+、Ca2+、Cl-的變化

與模型組比較，薏苡仁和炮制品法薏仁和陽性對照組大鼠尿液中156 h 前Na+、Cl-、K+量無顯著改變，差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但156 h 后，陽性對照組和法薏仁組的Na+、Cl-排出有顯著差異，表明薏苡仁的利尿作用初期未改變Na+、Cl-、K+的水平，但后期有促進Na+、Cl-排出的作用。各組實驗大鼠尿液的酸堿度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

各組實驗大鼠尿液中Na+、K +、Ca2+、Cl-濃度及酸堿度pH比較見圖2和3。

圖2 各組大鼠尿液中pH比較(x±s，n=10)

圖3 各組大鼠尿液中Na+、K+、Ca2+、Cl-量比較(x±s，n=10)

3.3 實驗大鼠血清中ALD、ANP和ADH含量的變化

法薏仁高、低劑量組、生薏仁和陽性對照組大鼠血清中ANP含量與對照組比較均呈增加趨勢，法薏仁高、低劑量組和陽性對照組大鼠ALD含量顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。法薏仁高、生薏仁組和陽性對照組大鼠抗利尿激素含量下降，差異未達顯著水平(P>0.05)，提示法薏仁的利尿作用機制與大鼠血清中ANP的分泌增加、減少血漿ALD的含量有關，結果比較見表3。

3.4 大鼠腎AQP1,2,3的表達變化

水通道蛋白(Aquaporin)，又名水孔蛋白，是分布在細胞膜上的蛋白質，形成細胞膜 “孔道”，可影響水在細胞的進出，陽性對照組和法薏仁高劑量AQP1表達水平明顯下降，且差異具有顯著性(P<0.05)，AQP2在陽性對照組和生薏仁組表達下降，且差異具有顯著性(P<0.05)，AQP3表達水平可見法薏仁高劑量組明顯下降，且差異具有顯著性(P<0.05)，反映出法薏仁和生薏仁對水通道蛋白的影響不一樣。

4 討論

薏苡仁是古老的藥食兩用，為歷代中醫(yī)最為常用的中藥之一，其薏苡仁性味歸經：甘、淡、微寒，歸脾、胃、肺經，薏苡仁具有利水滲濕，健脾止瀉，祛濕除痹，清熱排膿作用。法薏苡仁飲片屬于樟幫中藥炮制特色產品，是按照中藥炮制學理論,經過浸制，蒸制和炒制等數(shù)種復制后所得的薏苡仁炮制品種，其性由涼轉微溫，具有較好的健脾祛濕等效果[8-9]。本實驗發(fā)現(xiàn)生薏仁和法薏仁高劑量和低劑量均能促進尿的排出，但未發(fā)現(xiàn)生薏仁和法薏仁對尿液中K+的分泌與尿液酸堿pH有比較明顯的影響。

圖4 法薏仁對鹽水負荷的大鼠的水通道蛋白基因表達的影響

醛固酮ALD、心房鈉尿肽ANP、抗利尿激素ADH都可以影響尿液生成與排出，本實驗發(fā)現(xiàn)薏苡仁與呋塞米對ADH未見明顯影響；生薏仁、法薏仁和呋塞米可促進ANP的分泌、減少血清ALD的含量。ANP分泌增加會抑制ALD的分泌，而ANP分泌增加及ALD減少均會促進Na+和水的排泄，從而也解釋了法薏仁可增加鹽水負荷模型大鼠尿量與尿液中Na+、Cl-的排出，生薏仁和法薏仁對尿液pH和K+未見明顯影響。

存在于血液、腎臟、大腦等部位的水通道蛋白(Aquaporin，AQP)，具有選擇性的讓水分子通過的特性，其中AQP1,2,3,4與腎臟的尿液代謝有關[10]，選擇AQP1,2,3的基因表達情況了解了薏苡仁的利尿作用的關系，可見薏苡仁和法薏仁影響了不同的水通道蛋白的基因表達，這可能與薏苡仁和法薏仁的利尿靶點不同有關。