小鼠乳腺癌干細(xì)胞免疫相關(guān)分子表達(dá)和免疫浸潤(rùn)的分析

李昱陽(yáng)，李釗璇，羅云萍，陳 翀

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系, 北京 100005)

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)也稱為腫瘤起始細(xì)胞(tumor-initiating cells，TICs)，是一小群具有自我更新能力和分化潛能的腫瘤細(xì)胞亞群[1]，并且已在多種類型的惡性腫瘤中鑒定并分離出來[2-6]。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤起始、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根本原因[7]，也是目前腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)問題。

基因突變產(chǎn)生的抗原可以遞呈到腫瘤細(xì)胞表面，從而被機(jī)體的免疫細(xì)胞所識(shí)別和清除。然而，腫瘤細(xì)胞可以通過下調(diào)抗原加工與遞呈的分子通路來躲避機(jī)體免疫細(xì)胞的攻擊，并最終形成惡性腫瘤[8-10]。另外，許多研究已經(jīng)證實(shí)，腫瘤細(xì)胞可以上調(diào)具有免疫抑制作用的檢查點(diǎn)分子來抵抗免疫細(xì)胞的殺傷[11]。在臨床中，靶向免疫檢查點(diǎn)的治療讓許多晚期的腫瘤患者從中獲益，革命性地改變了腫瘤免疫治療現(xiàn)狀[12]。然而，關(guān)于腫瘤干細(xì)胞免疫原性和免疫逃逸的研究鮮有報(bào)道，腫瘤干細(xì)胞在抵抗免疫治療中的作用也不清楚。

為了探討腫瘤干細(xì)胞與機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的相互關(guān)系，本研究較為全面地分析了小鼠乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells, BCSCs)中免疫檢查點(diǎn)與抗原遞呈相關(guān)分子的表達(dá)情況，然后利用小鼠移植瘤模型在體內(nèi)研究乳腺癌干細(xì)胞成瘤后的免疫浸潤(rùn)特點(diǎn)，從而初步探討了小鼠乳腺癌干細(xì)胞免疫原性和免疫逃逸相關(guān)的表型特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：小鼠乳腺癌細(xì)胞系 4T1 和 4T07 (ATCC)。

1.1.2 動(dòng)物：SPF 級(jí) 6～8 周齡，Balb/c 雌鼠(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.1.3 試劑：RPMI 1640(Biological Industries 公司)；低吸附10 cm培養(yǎng)皿(Corning公司)；胎牛血清、100×青霉素鏈霉素(Gibco公司)；成球培養(yǎng)基(Stem Cell公司)；RT-qPCR試劑盒和 qPCR試劑盒(南京諾唯贊公司)；流式抗體：CD45-Percp、CD3-FITC、CD4-APC、CD8-APC、CD11b-APC、CD11c-APC和MHC2-FITC(Biolegend公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的成球培養(yǎng)：將處于對(duì)數(shù)增殖期的腫瘤細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，用無血清的成球培養(yǎng)基重懸，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為 1×103個(gè)/mL，在 37 ℃，5% CO2的孵箱中培養(yǎng) 7 d后用 70 μm的細(xì)胞篩收集腫瘤細(xì)胞球。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)免疫相關(guān)基因的mRNA：將所得到的貼壁細(xì)胞和細(xì)胞球分別用Trizol試劑收集，室溫裂解后加入三氯甲烷迅速混勻，在 4 ℃、12 000 r/min離心 15 min，收集上清液并加入等體積的異丙醇顛倒混勻，室溫靜置 10 min，在 4 ℃、12 000 r/min離心10 min后棄上清，用75%乙醇溶液洗滌兩次棄掉上清，室溫晾干沉淀，加入無RNase的無菌水溶解沉淀。按說明書操作將1 μg的 RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，利用SYRB Green法按說明書進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，并且分析基因在RNA水平的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)干性相關(guān)蛋白：提取總蛋白質(zhì)測(cè)定濃度后進(jìn)行 SDS-PAGE，每孔蛋白上樣量為 35 μg，恒流電泳 2 h。用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至 PVDF 膜，封閉后分別孵育一抗 SOX2、OCT4和β-actin過夜，次日洗膜3次后孵育二抗1 h，再次洗膜后滴加顯影液，拍攝條帶并用ImagJ軟件進(jìn)行吸光度掃描分析。

1.2.4 4T1 乳腺癌移植瘤模型的建立：將 8周齡的Balb/c雌鼠隨機(jī)分成兩組，每組6只。將成球培養(yǎng) 7 d后且直徑大于 70 μm的細(xì)胞球以及處于對(duì)數(shù)增殖期的4T1貼壁細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，分別用PBS重懸成 5×105個(gè)/mL，并接種 100 μL于小鼠右側(cè)的第四乳腺脂肪墊中。

1.2.5 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)各種免疫細(xì)胞的比例：將細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，重懸后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞調(diào)整為 1×106個(gè)/mL，離心后用 FACS 流式染液重懸，加入抗體(抗體∶細(xì)胞懸液 = 1∶100)，4 ℃避光孵育25 min后，用PBS洗滌1次后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。所得數(shù)據(jù)使用 BD 公司的FlowJo X 軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 乳腺腫瘤干細(xì)胞的富集和鑒定

小鼠乳腺癌細(xì)胞系 4T1 和4TO7 所形成的腫瘤細(xì)胞球的直徑基本都大于 70 μm，且數(shù)量較多(圖1A)。進(jìn)一步，與貼壁的腫瘤細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞球中干性基因 SOX2、OCT4和NANOG的 mRNA水平明顯上調(diào)(圖1B)，并且干性基因(SOX2 和 OCT4)的蛋白水平也明顯上調(diào)(圖 1C)。

2.2 乳腺腫瘤干細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)與抗原遞呈相關(guān)分子的表達(dá)

PD-L1 和 CD276 在 4T1 的腫瘤干細(xì)胞中明顯下調(diào)，而 Gal-9 的表達(dá)明顯上調(diào)(圖2A)；在 4T07 的腫瘤干細(xì)胞中，PD-L1 和 CD47 的表達(dá)明顯上調(diào)，而 CD276 和 Gal-9 的表達(dá)明顯下調(diào)(圖2B)?？乖f呈相關(guān)分子 B2m 在 4T1 和 4TO7 的腫瘤干細(xì)胞中都顯著上調(diào)，Nlrc5 的表達(dá)都明顯降低，而 Mr1、Tap2 和Tapbpl在這兩類乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)趨勢(shì)相反(圖3)。

2.3 乳腺癌荷瘤小鼠的脾臟和腫瘤組織中各類免疫細(xì)胞的比例

圖4A 和圖5A 示圈門策略。在兩組荷瘤小鼠的脾臟中，CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和 CD11c+MHCⅡ+DC 細(xì)胞所占的比例無明顯差異(圖4B～C,E)，然而 CD11b+細(xì)胞的比例在接種腫瘤干細(xì)胞的小鼠中明顯減少(圖4D)。

A.cellular morphology; B.mRNA levels; C.protein levels;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with adherent cells

A.4T1 cells; B.4TO7 cells; *P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001 compared with adherent cells圖2 小鼠乳腺腫瘤干細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)Fig 2 Expression of immune checkpoints of mouse breast cancer stem

A.4T1 cells; B.4TO7 cells;*P<0.05,**P<0.01 compared with adherent cells圖3 小鼠乳腺腫瘤干細(xì)胞抗原遞呈相關(guān)分子的表達(dá)Fig 3 Expression of antigen presentation related molecules of mouse breast cancer stem

腫瘤組織的流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)顯示，兩組小鼠腫瘤組織中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞(CD45+細(xì)胞)比例無明顯差異(圖5A)；但是，在接種了腫瘤干細(xì)胞的小鼠腫瘤組織中，CD4+T 細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞的浸潤(rùn)比例明顯增多(圖5B～C)，而CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)比例明顯降低(圖5D)，兩組中 CD11c+MHCⅡ+DC 細(xì)胞的浸潤(rùn)比例無明顯差異(圖5E)。提示，腫瘤干細(xì)胞可以招募更多的T 細(xì)胞，并且減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。

3 討論

腫瘤免疫檢查點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用獲得了2018年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，標(biāo)志著腫瘤免疫治療的新時(shí)代已經(jīng)到來。盡管過去對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的干性特征及其調(diào)控機(jī)制有較多研究[13-14]，但是目前關(guān)于腫瘤干細(xì)胞的免疫學(xué)特性卻鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，腫瘤干細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，并且不同類型的小鼠乳腺癌干細(xì)胞(4T1 和 4TO7)，其各種免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)不盡相同，提示腫瘤干細(xì)胞可能具有獨(dú)特的免疫逃逸潛能，而且不同類型的腫瘤干細(xì)胞其發(fā)生免疫逃逸的分子機(jī)制并不相同，因此基于免疫檢查點(diǎn)理論的治療策略需要更加精細(xì)和準(zhǔn)確。

小鼠乳腺癌細(xì)胞系 4T1和 4TO7經(jīng)過成球培養(yǎng)后，其中一些幫助抗原加工與遞呈的分子(B2m和TAP1等)有所上調(diào)，這與我們預(yù)期的腫瘤干細(xì)胞抗原遞呈通路受損的免疫逃逸機(jī)制有些不一致。最近關(guān)于正常組織干細(xì)胞免疫原性的研究發(fā)現(xiàn)，在毛囊和小腸組織中，增殖活躍的干細(xì)胞通過 Nlrc5 轉(zhuǎn)錄激活MHCⅠ類分子的表達(dá)，從而被 T 細(xì)胞識(shí)別并清除[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，Nlrc5在乳腺癌干細(xì)胞中確實(shí)低表達(dá)，推測(cè)其通過降低MHCⅠ類分子來逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視，這些結(jié)果提示乳腺癌干細(xì)胞的抗原遞呈途徑并沒有完全失活，靶向其中的關(guān)鍵分子，例如Nlrc5，也許可以增加腫瘤干細(xì)胞的抗原暴露，利于機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)其特異性的清除。

A．gating strategies；B.CD4+ cells；C.CD8+ cells；D.CD11b+ cells；E.dendritic cells; *P<0.05,**P<0.01 comparedwith adherent group

A．gating strategies； B.CD4+ cells； C.CD8+ cells； D.CD11b+ cells； E.dendritic cells; *P<0.05 comparedwith adherent group

腫瘤干細(xì)胞形成的腫瘤組織中浸潤(rùn)更多的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，然而與接種貼壁腫瘤細(xì)胞的小鼠相比，其腫瘤大小并沒有明顯的差異，推測(cè)，腫瘤干細(xì)胞雖然具有較高的免疫原性，但同時(shí)也更容易發(fā)生免疫逃逸來抵抗T細(xì)胞的清除。另外，也許腫瘤干細(xì)胞能夠招募更多適應(yīng)性免疫細(xì)胞的原因是腫瘤干細(xì)胞中存在更為豐富的腫瘤相關(guān)抗原，通過靶向腫瘤干細(xì)胞抗原的同時(shí)解除免疫抑制狀態(tài)也許是腫瘤免疫治療成功的關(guān)鍵。

綜上所述，本研究通過分析腫瘤干細(xì)胞中免疫相關(guān)分子的表達(dá)和對(duì)免疫細(xì)胞的招募，初步探討了腫瘤干細(xì)胞的免疫原性及機(jī)體的免疫反應(yīng)性，為進(jìn)一步探討腫瘤干細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的可能機(jī)制，以及針對(duì)腫瘤干細(xì)胞免疫原性及其特異性抗原的腫瘤治療策略提供了一定的理論基礎(chǔ)。