青梗菜游離小孢子培養(yǎng)關(guān)鍵因素研究

張 琨， 王一衡， 王 琦

(1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 山西 大同 037009；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 天津 300384)

青梗菜(BrassicacampestrisL. ssp.chinensisMakino var.communisTsen et Lee)是十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的一個變種，屬于小白菜中的一種，別名青菜、油菜等。其株型直立，頭大束腰，葉色亮綠，味道鮮嫩，營養(yǎng)價值高，是我國產(chǎn)銷量較大的蔬菜種類之一。選育優(yōu)質(zhì)、整齊度高、抗病、耐抽薹的青梗菜新品種始終是育種工作者的目標(biāo)。目前，生產(chǎn)上青梗菜主要是利用其異花授粉、天然雜交率高的特點(diǎn)進(jìn)行雜種優(yōu)勢育種。按常規(guī)育種程序推算，雜交前的連續(xù)多代自交純化親本需要5～8年，不僅費(fèi)時費(fèi)工，而且缺乏對市場需求變化的有效把握。近年來，隨著單倍體育種技術(shù)的不斷發(fā)展，利用游離小孢子培養(yǎng)快速創(chuàng)制純系、輔助傳統(tǒng)育種，已在白菜[1-2]、甘藍(lán)[3-4]、玉米[5]等作物的商業(yè)育種中得到了廣泛應(yīng)用，不僅大幅縮短育種周期，同時增加對有益遺傳性狀的選擇概率，顯著提高育種效率[6]。

自1973年Nitsch等[7]首次報道了毛曼陀羅游離小孢子培養(yǎng)獲得成功以來，以小孢子培養(yǎng)為核心的單倍體誘導(dǎo)技術(shù)已在200余種植物中得到了應(yīng)用[8]。青梗菜小孢子培養(yǎng)研究起步較晚，1992年曹鳴慶等[9]發(fā)表了包括青梗菜在內(nèi)的多種小白菜類蔬菜作物小孢子培養(yǎng)簡報，奠定青梗菜小孢子培養(yǎng)的技術(shù)基礎(chǔ)。此后，研究人員對青梗菜小孢子胚誘導(dǎo)因素等進(jìn)行大量探索，并取得較大進(jìn)展[10-12]。2009年，馮輝等[13]率先通過游離小孢子培養(yǎng)創(chuàng)制出青梗菜雙單倍體(Doubled Haploid，DH)系，并成功應(yīng)用于雜交選育實(shí)踐。然而，青梗菜小孢子培養(yǎng)由于受供體植株基因型、培養(yǎng)預(yù)處理以及培養(yǎng)基種類等多方面因素的影響，其出胚率不高、胚狀體成苗率低等仍是實(shí)際應(yīng)用中的一大難題。為此，本研究以10種不同基因型青梗菜為試材，對小孢子培養(yǎng)中影響胚發(fā)生和胚成苗的關(guān)鍵因素進(jìn)行研究，為優(yōu)化青梗菜小孢子培養(yǎng)體系、高效穩(wěn)定地獲得青梗菜DH株系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗以10份不同基因型青梗菜材料為供體進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)(表1)。8月底將萌動的青梗菜種子在4 ℃低溫條件下春化20 d，9月中旬播種，10月底移栽于溫室。采用常規(guī)栽培管理方法，于12月初至翌年3月開花取樣進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。

1.2 方 法

1.2.1小孢子分離和培養(yǎng)

于盛花期，從健壯植株上取2～3 mm長的花蕾(單核靠邊期)，4 ℃低溫預(yù)處理1 d。參照黃天虹等[14]的方法分離、純化小孢子后，用1/2 NLN培養(yǎng)基進(jìn)行小孢子懸浮培養(yǎng)。按每皿4個花蕾的小孢子密度，將小孢子懸浮液以每皿5 mL分裝于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，Parafilm膜封口。33 ℃暗培養(yǎng)下熱激處理1 d，轉(zhuǎn)至25 ℃恒溫箱中繼續(xù)暗培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計小孢子胚數(shù)目。

表1 供試青梗菜及來源

1.2.2各因素對小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生能力影響分析

基因型試驗：以上述10個青梗菜品種為試材，在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2 NLN上培養(yǎng)。

溫度試驗：以易出胚基因型N 1、N 2和難出胚基因型N 7、N 8為材料，分別進(jìn)行接種前4 ℃低溫預(yù)處理和接種后33 ℃高溫預(yù)培養(yǎng)試驗。高、低溫處理時間設(shè)置0、1、2、3、4 d各5個試驗處理組。所有處理均培養(yǎng)于1/2 NLN培養(yǎng)基，試驗以未經(jīng)溫度處理的材料為對照。

植物生長調(diào)節(jié)劑試驗：選擇N 2、N 5和N 9為處理材料，以1/2 NLN培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，共設(shè)計8種不同濃度配比的激素組合(表3)，試驗以未添加激素處理的材料為對照。

各試驗中每個處理設(shè)置重復(fù)3次，每個重復(fù)5皿，20 d后統(tǒng)計小孢子的出胚數(shù)。

1.2.3小孢子培養(yǎng)植株再生

將易出胚材料N 1、N 2獲得的不同發(fā)育時期的胚狀體，接種于MS +100 mg/L活性炭的胚狀體再生培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)室(25 ℃，2 000 lx、16 h光照/d)培養(yǎng)至胚狀體長出真葉，轉(zhuǎn)入1/2 MS+0.10 mg/L NAA生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計植株生根情況。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對小孢子胚誘導(dǎo)率的影響

試驗結(jié)果顯，供試的10個青梗菜品種在小孢子培養(yǎng)20 d后全部獲得了胚狀體(圖1)，但不同基因型的出胚率差異顯著(表2)。出胚率最高的是N 1，平均每花蕾出胚6.42個；最低的是N 10，平均每花蕾出胚0.17個，二者相差達(dá)38倍。按照胚胎發(fā)生能力，可將供試材料分為易出胚、中出胚和難出胚三類基因型。其中，易出胚基因型2個，中出胚基因型4個，難出胚基因型4個，表明不同基因型對青梗菜小孢子胚胎形成影響很大。

表2 不同基因型對青梗菜小孢子出胚率的影響Table 2 Effect of genotypes on formation of microspore-derived embryos in pakchoi

圖1 青梗菜小孢子培養(yǎng)20 d后形成的胚狀體Fig.1 Microspore-derived embryoids after 20 days culture in pakchoi

2.2 溫度處理對小孢子胚誘導(dǎo)率的影響

從圖2可見，接種前對青梗菜花蕾進(jìn)行1 d的4 ℃低溫預(yù)處理，可提高小孢子胚誘導(dǎo)率，但處理超過2 d，小孢子出胚率則明顯降低。如圖3所，接種后的高溫誘導(dǎo)是小孢子成胚的關(guān)鍵。供試不同基因型材料未經(jīng)33 ℃高溫處理，均未形成胚狀體；1～2 d的熱激處理條件對青梗菜誘導(dǎo)出胚最為有利，熱激超過2 d，誘導(dǎo)效果下降。

圖2 低溫預(yù)處理對青梗菜小孢子出胚率的影響Fig.2 Effect of low-temperature pretreatment on formation of microspore-derived embryos in pakchoi

圖3 熱激處理對青梗菜小孢子出胚率的影響Fig.3 Effect of heat shock treatment on formation of microspore-derived embryos in pakchoi

2.3 外源激素對小孢子胚誘導(dǎo)率的影響

在1/2 NLN培養(yǎng)基中添加較低濃度的NAA和6-BA，有助于促進(jìn)青梗菜小孢子胚狀體誘導(dǎo)。表3說明，在未添加外源激素的培養(yǎng)基(A)中，雖可誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生，但產(chǎn)胚量較低。此外，加入較高濃度激素(H)，也會對青梗菜小孢子胚胎發(fā)生產(chǎn)生抑制作用。本試驗中0.20 mg/L NAA+0.05 mg/L 6-BA的外源激素組合對青梗菜小孢子胚誘導(dǎo)效果最好。

表3 激素處理對青梗菜小孢子出胚率的影響Table 3 Effect of hormone treatment on formation of microspore-derived embryos in pakchoi

2.4 胚狀體發(fā)育時期對小孢子植株再生的影響

從表4可以看出，青梗菜小孢子誘導(dǎo)形成的胚狀體，存在子葉形胚、魚雷形胚、心形胚等不同發(fā)育階段類型，胚胎發(fā)育表現(xiàn)出不同步現(xiàn)象。不同基因型材料中子葉形胚的占比最大，將子葉形胚依次轉(zhuǎn)至再生培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，胚狀體逐漸變綠(圖4 a)，其中75%以上的子葉形胚經(jīng)分化、發(fā)育(圖4 b、c)，可形成根芽俱全的再生植株(圖4 d)。魚雷形胚和心形胚經(jīng)分化發(fā)育也可誘導(dǎo)植株再生，但成苗數(shù)和成苗率較低。圓球形胚在此過程中分化困難，多數(shù)褐化死亡。由此可見，子葉形胚再生成苗能力最強(qiáng)，胚狀體所處發(fā)育階段是影響胚成苗的關(guān)鍵。

注：a為小孢子胚狀體萌發(fā)；b為小孢子胚分化；c為小孢子培養(yǎng)試管苗；d為再生苗誘導(dǎo)生根。圖4 青梗菜小孢子植株再生過程Fig.4 The regeneration of microspore-derived plant of pakchoi

表4 胚狀體發(fā)育時期對青梗菜小孢子胚植株再生的影響Table 4 Effect of embryoid development stage on microspore-derived plant regeneration in pakchoi

3 討論與結(jié)論

游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在蕓薹屬作物中已得到廣泛研究，但小孢子出胚率和再生率普遍較低始終是限制其高效應(yīng)用的重要障礙。在影響小孢子培養(yǎng)的眾多因素中，基因型對胚胎發(fā)生及培養(yǎng)能否獲得成功具有決定性作用。研究表明，不同基因型大白菜的產(chǎn)胚率差別很大，從3.8～42.4胚/蕾不等[15]。甘藍(lán)型油菜低出胚基因型和高出胚基因型相比，其胚胎誘導(dǎo)率相差百倍以上[16]。小白菜大部分基因型產(chǎn)胚率不高，胚產(chǎn)量普遍在5胚/蕾以下[10-14]。本研究所選用的10個青梗菜基因型材料，全部獲得了小孢子胚，基因型反應(yīng)范圍達(dá)100%，但不同基因型間產(chǎn)胚率差異極大，明顯形成了易出胚、中出胚和難出胚三類基因型。其中易出胚基因型N 1是難出胚基因型N 10的38倍，證明了基因型對青梗菜小孢子誘導(dǎo)胚胎形成有顯著影響。有研究發(fā)現(xiàn)，將較難出胚的基因型通過雜交方法轉(zhuǎn)移至易出胚基因型，可擴(kuò)大小孢子胚胎發(fā)生的基因型范圍，提高胚誘導(dǎo)率[17]。在實(shí)際工作中，可利用此特點(diǎn)使一些農(nóng)藝性狀好但出胚率低的種質(zhì)資源得以利用。

溫度是影響小孢子培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一。在小孢子接種前，4 ℃低溫預(yù)處理花蕾，有利于啟動脫分化和提高小孢子成胚效率[18]。黃天虹等[14]發(fā)現(xiàn)接種前的低溫脅迫處理對不結(jié)球白菜小孢子胚胎發(fā)生是必需的，未經(jīng)低溫預(yù)處理的小孢子難以誘導(dǎo)胚狀體形成。耿建峰等[19]則認(rèn)為，低溫預(yù)處理對白菜小孢子胚誘導(dǎo)率影響不大。本試驗結(jié)果表明，未經(jīng)低溫預(yù)處理的青梗菜小孢子也可誘導(dǎo)胚胎發(fā)生，4 ℃處理1 d可明顯提高其胚誘導(dǎo)率，但超過2 d誘導(dǎo)率反而降低，這可能是短時間低溫處理可使小孢子保持較高的生物活性，而處理時間過長則會使小孢子活力降低，難以啟動脫分化。接種后給予短時熱激處理，可提高小孢子培養(yǎng)的效率[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱激處理對青梗菜小孢子胚狀體誘導(dǎo)十分關(guān)鍵。對青梗菜小孢子于33 ℃進(jìn)行1～2 d的熱激處理后，明顯提高了胚狀體誘導(dǎo)頻率，熱激超過2 d，誘導(dǎo)率反而下降，這與耿建峰等[19]的研究結(jié)論相似。

外源激素對不同蕓薹屬作物小孢子胚發(fā)生的影響存在一定差異。多數(shù)研究認(rèn)為，在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加一定濃度的生長素和細(xì)胞分裂素，可顯著提高胚狀體誘導(dǎo)效果[12-13,21-22]。但也有報道發(fā)現(xiàn)，外源激素對小孢子胚誘導(dǎo)率作用不大[19]，甚至超過適宜濃度時還會出現(xiàn)抑制作用[11-21]。在本試驗中，低濃度NAA(0.20 mg/L)和6-BA(0.05 mg/L)對青梗菜小孢子胚誘導(dǎo)效果最好，不加外源激素的培養(yǎng)基產(chǎn)胚量較低，說明外源激素是影響青梗菜小孢子胚誘導(dǎo)的重要因素。同時高濃度激素反而阻止了青梗菜小孢子胚胎的形成，推測可能是過量激素對小孢子產(chǎn)生了毒害作用。

小孢子胚的質(zhì)量是影響其能否發(fā)育成苗的內(nèi)在因素，選擇適宜發(fā)育階段的胚狀體可有效提高再生成苗的成功率。申書興等[23]研究表明，通過小孢子培養(yǎng)獲得的胚狀體其發(fā)育存在不同步性，往往是子葉形胚、魚雷形胚、心形胚、圓球形胚及畸形胚等多種不同類型并存，不同類型胚狀體胚成苗率不同，其中子葉形胚成苗能力最強(qiáng)。本研究結(jié)果顯，子葉形胚成苗率最高，少量魚雷形胚和心形胚能萌發(fā)轉(zhuǎn)綠，但大部分不能分化成苗，圓球形胚和畸形胚不能成活，多數(shù)褐化死亡。因此，如何有效提高青梗菜小孢子胚發(fā)育的同步性，促進(jìn)子葉形胚的大量形成和正常發(fā)育，是決定青梗菜小孢子植株再生的關(guān)鍵，也是后續(xù)研究工作的一大重點(diǎn)。