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    貝那普利對肝纖維化大鼠NOX4和Nrf2的影響

    2022-06-26 07:11:06申風(fēng)俊
    關(guān)鍵詞:光密度那普利氧化應(yīng)激

    李 靜,申風(fēng)俊

    (山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:919016603@qq.com)

    肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是一個細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的病理性過程,目前已知,氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)和腎素-血管緊張素系統(tǒng)在肝纖維化的進(jìn)展過程中都發(fā)揮了重要的作用,且兩者相互作用。氧化系統(tǒng)及抗氧化系統(tǒng)的平衡在機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持中起著重要作用。肝臟的內(nèi)環(huán)境在氧化代謝產(chǎn)物活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成與消除中維持著動態(tài)平衡,各種病因?qū)е碌母卫w維化均有氧化應(yīng)激的參與。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)是機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)的一個多蛋白復(fù)合體,是目前已知唯一的專職產(chǎn)生ROS的酶類[1]。當(dāng)機(jī)體受到氧化性刺激因素作用時,NOX4能夠促進(jìn)ROS產(chǎn)生,介導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。有研究表明,在肝臟組織和被血清培養(yǎng)激活的原代造血干細(xì)胞中,NOX4 mRNA明顯增多,而在缺乏NOX4的造血干細(xì)胞中,ROS生成則被減弱[2]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)作用于各種酶轉(zhuǎn)錄因子,在抑制肝臟炎癥的發(fā)展中起著重要作用。對小鼠的功能性分析表明,Nrf2通過改善纖維生成對慢性肝病的起始和進(jìn)展起保護(hù)作用。人肝組織免疫組化分析顯示,慢性肝病患者肝組織中氧化應(yīng)激水平升高,Nrf2表達(dá)增加[3]。局部腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)的經(jīng)典RAS途徑中,血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是核心效應(yīng)分子,它是一種重要的炎癥促進(jìn)因子,能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成以及細(xì)胞增殖,促進(jìn)纖維化的形成。腎素血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)在長期治療高血壓的過程中,可抑制心肌重塑,能夠用來治療心力衰竭,因此認(rèn)為ACEI有抗纖維化的作用。許瑩瑩等[4]通過觀察發(fā)現(xiàn),ACEI類藥物貝那普利能夠升高Nrf2 mRNA、降低NOX4 mRNA水平,顯著改善肝纖維化的程度。但對于貝那普利是否能夠影響NOX4及Nrf2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平,進(jìn)而影響肝纖維化的發(fā)生發(fā)展鮮有研究。本實(shí)驗(yàn)建立四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型,用免疫組化的方法研究貝那普利是否可以通過影響NOX4和Nrf2的表達(dá),進(jìn)而干預(yù)肝纖維化的進(jìn)程,并探討血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑抗肝纖維化的機(jī)制,為臨床防治肝纖維化尋找新的治療靶點(diǎn)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    清潔級健康雄性SD大鼠購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心;四氯化碳購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;貝那普利由北京諾華制藥有限公司提供;NOX4和Nrf2抗體試劑盒和多聚體抗兔IgG-HRP試劑盒購于太原市正和生物科技有限公司;DAB顯色試劑盒、二甲苯、乙醇等由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科提供。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    將22只清潔級健康雄性SD大鼠(180~210 g)隨機(jī)分為3組:對照組6只,模型組8只,治療組8只。模型組及治療組予40%四氯化碳皮下注射,初始劑量為5 ml/kg,之后劑量為2 ml/kg,2次/周,共8周;對照組予等劑量油劑皮下注射,2次/周,共8周。在造模同時,治療組予貝那普利灌胃,劑量為10 mg/(kg·d),對照組和模型組予等劑量生理鹽水灌胃,共8周。三組大鼠均給予正常飲食,在結(jié)束給藥當(dāng)天(即實(shí)驗(yàn)第56天)分別隨機(jī)處死各組大鼠6只,留取相同部位肝組織待用。貝那普利劑量選定:既往學(xué)者在研究ACEI類藥物貝那普利對心臟和腎臟影響的實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)貝那普利10 mg/(kg·d)可有效降低膠原表達(dá),改善動脈血管重塑[5-7],因此,我們也采用此實(shí)驗(yàn)劑量研究了貝那普利對肝臟纖維化的影響。

    1.3 標(biāo)本獲取及處理

    各組大鼠處死前禁食12 h,嚴(yán)格遵循無菌原則,用25%烏拉坦(4 ml/kg)麻醉,無菌手術(shù)刀打開腹腔(同時觀察有無腹水和腹水量,做好記錄),觀察并記錄肝臟大體特征(形態(tài)、顏色、大小、質(zhì)地等),留取相同部位肝組織,0.9%氯化鈉溶液沖洗后固定、脫水、透明、包埋,切片行HE及Masson染色。免疫組化法測定肝組織中NOX4和Nrf2水平:400倍光鏡下隨機(jī)選擇3個視野,Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行定量分析,計(jì)算NOX4和Nrf2陽性蛋白的平均光密度值。平均光密度值越高,說明陽性蛋白表達(dá)量越多。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 病理學(xué)表現(xiàn)

    肉眼觀察:對照組大鼠肝臟體積正常,紅褐色,質(zhì)軟,表面和邊緣光滑,組織彈性好。與對照組相比,模型組大鼠肝臟體積減小,呈土黃色,質(zhì)較硬,表面可觸及顆粒樣改變。治療組大鼠肝臟體積介于對照組和模型組之間,略呈土黃色,質(zhì)較韌,表面顆粒樣改變較模型組輕。

    病理組織學(xué):對照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常,肝小葉結(jié)構(gòu)完好。與對照組相比,模型組可見明顯變性、壞死,肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,有假小葉形成,大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比,治療組肝組織變性、壞死減輕,纖維條索較模型組窄(見圖1)。

    圖1 三組大鼠第8周肝組織HE染色和Masson染色病理結(jié)果 (×40)Figure 1 Pathological changes of liver tissue by HE staining and Masson staining at the 8th week in the three groups (×40)

    2.2 各組肝組織中NOX4和Nrf2陽性蛋白的表達(dá)

    NOX4陽性蛋白和Nrf2陽性蛋白顯色均為棕黃色,NOX4陽性蛋白定位于肝細(xì)胞胞漿、纖維間隔及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞;Nrf2陽性蛋白顯色主要定位于肝細(xì)胞胞漿(見圖2)。光學(xué)顯微鏡(×400)下觀察,可見對照組無明顯NOX4和Nrf2陽性蛋白。與對照組相比,模型組肝組織中NOX4和Nrf2陽性蛋白的平均光密度值升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,治療組肝組織NOX4陽性蛋白平均光密度值降低,Nrf2陽性蛋白平均光密度值升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

    圖2 三組大鼠第8周肝組織NOX4和Nrf2陽性蛋白蘇木精染色結(jié)果 (×400)Figure 2 NOX4 and Nrf2 positive proteins in liver tissues at the 8th week in the three groups by HE staining (×400)

    表1 各組大鼠肝組織NOX4和Nrf2陽性蛋白的平均光密度值比較Table 1 Comparison of mean optical density values of NOX4 and Nrf2 positive proteins in liver tissues of rats in each

    3 討論

    肝纖維化是包括病毒、酒精、免疫等多種致病因素導(dǎo)致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理性過程,以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過多沉積為特征。氧化應(yīng)激指機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡,偏向于氧化,導(dǎo)致以中性粒細(xì)胞為代表的炎癥細(xì)胞浸潤,大量的氧化產(chǎn)物堆積并損傷機(jī)體。越來越多的證據(jù)表明,氧化應(yīng)激機(jī)制參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[8-11]?;钚匝醮豏OS是氧化損傷過程中產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物,其產(chǎn)生和清除能力的不平衡導(dǎo)致了氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。生理?xiàng)l件下,ROS在機(jī)體內(nèi)少量存在,發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抵御有害微生物的作用[12]。病理?xiàng)l件下,即發(fā)生氧化因素?fù)p傷時,機(jī)體產(chǎn)生大量ROS,導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生,損傷機(jī)體微環(huán)境[13]。ROS作為氧化敏感蛋白,可以激活氧化和抗氧化系統(tǒng)的分子表達(dá),進(jìn)一步調(diào)節(jié)肝纖維化[8]。血管緊張素Ⅱ作為RAS系統(tǒng)的核心促纖維化因子,可以通過多條信號通路介導(dǎo)ROS產(chǎn)生,參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

    還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)是機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)的一個多蛋白復(fù)合體,是目前已知的唯一一種專職產(chǎn)生ROS的酶類[1],NOX4是其中一種,其在肝枯否細(xì)胞(Kupffer cells,KCs)和肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)中高度表達(dá)。當(dāng)機(jī)體受到氧化刺激損傷時,NOX4的調(diào)節(jié)亞基發(fā)生磷酸化,易位至細(xì)胞膜,激活下游氧化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),促使ROS的產(chǎn)生,介導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。

    在肝硬化患者的血清中,NOX4蛋白表達(dá)水平升高,但在敲除了NOX4基因的肝纖維化小鼠模型中,肝臟的炎癥程度、氧化應(yīng)激水平及肝纖維化的程度均有明顯下降[2]。在小鼠原代肝細(xì)胞和一種人肝細(xì)胞系中,血管緊張素Ⅱ的活化增加了NOX4蛋白的表達(dá)量以及由H2O2活化介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]。在本實(shí)驗(yàn)中,與對照組相比,模型組大鼠肝細(xì)胞中NOX4平均光密度值升高,給予貝那普利治療后,NOX4平均光密度值降低,因此我們猜測貝那普利可以通過抑制血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換為血管緊張素Ⅱ,抑制NOX4的活化,減少ROS的產(chǎn)生,減輕肝纖維化。

    核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是抗氧化反應(yīng)元件(ARE)介導(dǎo)的基因表達(dá)的中心調(diào)控因子[15],由紅細(xì)胞衍生核因子2樣蛋白2(NFE2L2)編碼,屬于堿性亮氨酸轉(zhuǎn)錄因子家族。Nrf2可以調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá),編碼抗氧化酶、解讀因子、抗凋亡蛋白和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體[16]。生理狀態(tài)下,大部分Nrf2與細(xì)胞質(zhì)錨連分子Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(KEAP1)結(jié)合而被蛋白酶降解,只有少部分用于維持還原型谷胱甘肽(GSH)的基礎(chǔ)表達(dá)。Nrf2在所有類型的細(xì)胞中均有表達(dá),正常情況下,其基礎(chǔ)蛋白水平通常較低,這主要是由于KEAP1介導(dǎo)的蛋白酶體降解作用[17]。氧化應(yīng)激條件下,Nrf2 基因被激活,與磷酸化的KEAP1解離,激活下游的抗氧化基因。Nrf2可以調(diào)節(jié)GSH的氧化還原狀態(tài),保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷,Nrf2的基因或藥理激活可以抑制急性炎癥性肝損傷[18]。Nrf2可以直接抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生或抑制NF-κB的活性來抑制炎癥[19]。另有研究表明,經(jīng)基因或藥理激活的Nrf2可以保護(hù)肝臟免受多種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷[20,21]。對人類肝臟切片的免疫組化分析顯示慢性肝臟病患者Nrf2高表達(dá)[22]。因此人們認(rèn)為Nrf2可以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用,使機(jī)體保持氧化還原穩(wěn)態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中,肝纖維化模型組Nrf2在細(xì)胞漿中的平均光密度值較對照組升高,治療組較模型組進(jìn)一步升高。因此我們推測,貝那普利可以通過升高Nrf2表達(dá)量來抑制氧化應(yīng)激損傷。

    綜上所述,氧化應(yīng)激條件下,NOX4和Nrf2均參與了肝纖維化的過程,我們推測,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑貝那普利可以抑制NOX4的產(chǎn)生和促進(jìn)Nrf2的產(chǎn)生,發(fā)揮抑制肝纖維化的作用,但其長期效用仍有待繼續(xù)研究。

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