如皋黃雞不同產(chǎn)蛋時(shí)期卵巢卵泡變化規(guī)律分析

丁悅 張金璧 周欣怡 梁多敏 陳寬鳳 張艷婧 謝永鋒 邱家寶 徐世永

摘要：為探索不同產(chǎn)蛋時(shí)期如皋黃雞卵巢卵泡變化規(guī)律，選取預(yù)產(chǎn)期（16周齡）、產(chǎn)蛋初期（20周齡）、產(chǎn)蛋高峰期（27周齡）、產(chǎn)蛋末期（64周齡）如皋黃雞蛋雞，對(duì)輸卵管、卵巢重量、等級(jí)前卵泡數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同時(shí)卵巢進(jìn)行組織切片HE染色后對(duì)原始、初級(jí)、次級(jí)卵泡進(jìn)行了觀察和測(cè)量統(tǒng)計(jì)，對(duì)不同階段卵泡的數(shù)量變化進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明：隨產(chǎn)蛋時(shí)期的推進(jìn)，卵巢、輸卵管重呈上升趨勢(shì)，4種等級(jí)前卵泡數(shù)量在產(chǎn)蛋高峰期達(dá)最高值;次級(jí)卵泡數(shù)量在預(yù)產(chǎn)期最高，不同直徑的次級(jí)卵泡數(shù)量在產(chǎn)蛋期進(jìn)程中變化規(guī)律有所不同;此外，初級(jí)卵泡平均直徑在不同產(chǎn)蛋時(shí)期亦有差異。

關(guān)鍵詞：卵巢;等級(jí)前卵泡;次級(jí)卵泡;如皋黃雞;產(chǎn)蛋時(shí)期

中圖分類號(hào)：S 831文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：0253-2301（2022）04-0028-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2022.04.005

Analysis on the Change Rules of Ovarian Follicles in Rugao Yellow Chickensat Different Laying Periods

DING Yue， ZHANG Jin-bi*， ZHOU Xin-yi， LIANG Duo-min， CHEN Kuan-feng，ZHANG Yan-jing， XIE Yong-feng， QIU Jia-bao， XU Shi-yong

（College of Animal Science and Food Engineering， Jinling Institute of Technology， Nanjing， Jiangsu 210000， China）

Abstract： In order to explore the change rules of ovarian follicles in Rugao yellow chickens at different laying periods， by selecting the Rugao yellow chickens at the prelaying period （16 wk of age）， the early laying period （20 wk of age）， peak egg-laying period （27 wk of age）， and the telophase of laying （64 wk of age）， the statistics of the weight of oviduct， the ovarian weight， and the number of pre-hierarchical follicles were carried out. At the same time， theoriginal， primary and secondary follicles were observed and measured after the tissue section and HE staining of ovary， and the number changes of follicles at different stages were compared and analyzed. The results showed that the weight of ovary and fallopian tube showed an increasing trend with the development of laying period， and the number of four kinds of pre-hierarchical follicles reached the highest value at the peak egg-laying period. The number of the secondary follicles was the highest in the prelaying period， and the number of the secondary follicles with different diameters varied in the course of laying period. In addition， the average diameter of the primary follicle was also different at different laying periods.

Key words： Ovary; Pre-hierarchical follicles; Secondary follicle; Rugao yellow chicken; Laying period

如皋黃雞俗稱三黃雞，具有黃喙、黃羽、黃腳特征，是江蘇特色蛋肉兼用型雞種，以江蘇省如皋市及其周邊城市為主要產(chǎn)區(qū)，2013年進(jìn)入全國(guó)農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志登記保護(hù)名錄。如皋黃雞不僅是我國(guó)重要的家禽種質(zhì)資源，其產(chǎn)蛋量較高且體重小，具有作為優(yōu)良蛋雞雜交親本的潛力[1]。家禽沒有發(fā)情周期和妊娠期，在一定的時(shí)間內(nèi)連續(xù)排卵，產(chǎn)蛋期可分為預(yù)產(chǎn)期、產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋中期（即蛋高峰期）和產(chǎn)蛋后期。蛋雞的產(chǎn)蛋期長(zhǎng)短直接關(guān)系到整個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益[2-3]，如皋黃雞與現(xiàn)代蛋雞品種類似，一般在20～21周齡開始產(chǎn)蛋;27～29周齡進(jìn)入產(chǎn)蛋高峰期，大致可持續(xù)20周;54周齡后逐漸進(jìn)入產(chǎn)蛋末期。

一般來說，家禽卵巢中卵泡的數(shù)量及發(fā)育狀況是其產(chǎn)蛋性能的主要決定因素，出雛時(shí)雞卵巢中的卵母細(xì)胞經(jīng)過發(fā)育、選擇和閉鎖等機(jī)制建立起嚴(yán)格的等級(jí)體系[4]，分為原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和成熟卵泡，成熟卵泡又分為等級(jí)前卵泡與等級(jí)卵泡[5-6]。等級(jí)前卵泡可根據(jù)體積大小和卵泡內(nèi)卵黃物質(zhì)沉積情況分為小白卵泡（SWF）、大白卵泡（LWF）、小黃卵泡（SYF）和大黃卵泡（LYF），而大黃卵泡會(huì)通過選擇與優(yōu)勢(shì)化形成等級(jí)卵泡，進(jìn)入等級(jí)發(fā)育時(shí)期，按順序發(fā)育直至排卵[7]。理論上說，卵巢中卵泡的數(shù)量和質(zhì)量是蛋雞產(chǎn)蛋的物質(zhì)基礎(chǔ)，原始卵泡庫的庫存、初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的儲(chǔ)備以及各級(jí)卵泡的閉鎖消耗的速率決定了家禽的生育年限[8]。因此，了解和完善各產(chǎn)蛋期的卵巢卵泡變化規(guī)律，有助于完善家禽產(chǎn)蛋生理機(jī)制，從而進(jìn)一步開發(fā)家禽產(chǎn)蛋潛力[9]。D765F16B-4BFE-414D-9135-AE9A51FC7318

然而由于等級(jí)前卵泡肉眼難以直接觀察，針對(duì)等級(jí)前卵泡的觀察和統(tǒng)計(jì)較為少見[10]，且如皋黃雞產(chǎn)蛋各時(shí)期的卵巢卵泡變化未有報(bào)道。本研究針對(duì)預(yù)產(chǎn)期、產(chǎn)蛋初期、產(chǎn)蛋高峰期和產(chǎn)蛋末期的如皋黃雞，通過采樣統(tǒng)計(jì)和組織切片、HE染色法及顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)的方法，從大體和顯微角度比較了不同產(chǎn)蛋時(shí)期母雞生殖器官的大體變化和不同階段卵泡的數(shù)量變化，探討了不同產(chǎn)蛋時(shí)期的卵泡數(shù)變動(dòng)規(guī)律，為蛋雞的生殖調(diào)控提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物如皋黃雞購自南京竹順生物公司，分批選取同等條件下飼養(yǎng)的預(yù)產(chǎn)期（16周齡）、產(chǎn)蛋初期（20周齡）、產(chǎn)蛋高峰期（27周齡）、產(chǎn)蛋末期（64周齡）如皋黃雞蛋雞各12只。

1.1.2主要試劑與儀器生物顯微鏡（CHC，OLYMPUS），輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（RM2128，Leica），4%多聚甲醛固定液、HE染色、PBS液等購自上海生工公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣本采集頸部放血處死后采集輸卵管并稱重，測(cè)量輸卵管長(zhǎng)度。取包括各級(jí)卵泡在內(nèi)的整個(gè)卵巢組織，去等級(jí)卵泡后稱重，測(cè)量并記錄直徑≥1 mm的卵泡數(shù)。各級(jí)前卵泡按直徑大小依次劃分為大黃卵泡（直徑8～10 mm）、小黃卵泡（直徑5～7 mm）、大白卵泡（直徑2～5 mm）、小白卵泡（直徑1～2 mm）。卵巢去掉≥1 mm卵泡后，將剩余組織放入4%多聚甲醇固定液進(jìn)行保存用于制作石蠟切片。

1.2.2卵巢組織切片的制作及觀察固定好的卵巢組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、按5 μm厚度進(jìn)行蠟塊切片，切片方向采取與卵巢系膜平行方向，取最大切片進(jìn)行HE染色以獲得更準(zhǔn)確的卵泡計(jì)數(shù)[11]。

1.2.3卵巢組織切片的制作、觀察及卵泡計(jì)數(shù)將固定后的卵巢組織送至生物科技公司脫水，石蠟包埋組織，制作石蠟切片，HE染色。顯微鏡觀察每張玻片中不同階段的卵泡，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為：原始卵泡卵母細(xì)胞周圍緊貼單層扁平狀顆粒細(xì)胞，排列不規(guī)則;初級(jí)卵泡卵母細(xì)胞周圍緊貼單層柱狀顆粒細(xì)胞，排列整齊;次級(jí)卵泡卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞變?yōu)槎鄬忧覂?nèi)有大量卵泡液[3]。同時(shí)對(duì)各級(jí)卵泡直徑進(jìn)行測(cè)量，對(duì)初級(jí)和次級(jí)卵泡進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism 7（GraphPad Software Inc，San Diego，CA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。三組間差異采用one-way ANOVA，二組間比較采用非配對(duì)T檢驗(yàn)。所有結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）。P<0.05和P<0.01分別表示差異顯著和極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1不同產(chǎn)蛋時(shí)期卵巢及輸卵管的大體變化分析

由圖1可知，不同產(chǎn)蛋時(shí)期，如皋黃雞卵巢均重變化明顯，預(yù)產(chǎn)期、產(chǎn)蛋初期、產(chǎn)蛋高峰期和產(chǎn)蛋末期均重分別為（0.8±0.13）、（3.8±0.70）、（42.2±2.90）和（53.2±3.85）g，4個(gè)時(shí)期卵巢均重間差異顯著（P<0.05）。在輸卵管重方面，預(yù)產(chǎn)期、產(chǎn)蛋初期、產(chǎn)蛋高峰期和產(chǎn)蛋末期均重分別為（1.7±1.11）、（34.1±6.68）、（34.6±2.39）和（1.8±2.85）g，產(chǎn)蛋初期與高峰期差異不顯著（P>0.05），預(yù)產(chǎn)期和產(chǎn)蛋末期輸卵管均重顯著低于產(chǎn)蛋初期和顯著高于產(chǎn)蛋高峰期（P<0.05）。預(yù)產(chǎn)期、產(chǎn)蛋初期、產(chǎn)蛋高峰期和產(chǎn)蛋末期的輸卵管平均長(zhǎng)度分別為（12.6±1.38）、（49.7±6.76）、（45.6±2.73）、（59.1±1.20）cm，其變化趨勢(shì)規(guī)律與輸卵管重量一致，預(yù)產(chǎn)期和產(chǎn)蛋末期輸卵管長(zhǎng)度顯著低于產(chǎn)蛋初期和顯著高于和產(chǎn)蛋高峰期（P<0.05）。

2.2不同產(chǎn)蛋時(shí)期卵巢等級(jí)前卵泡數(shù)量變化分析

由圖2可知，大黃卵泡（BYF）在產(chǎn)蛋初期、產(chǎn)蛋高峰期、產(chǎn)蛋末期平均個(gè)數(shù)分別為（4.6±0.78）、（7.4±1.43）、（6.2±0.94）個(gè)，但差異未達(dá)到顯著水平（圖2A）。小黃卵泡（SYF）在這3個(gè)時(shí)期平均個(gè)數(shù)分別為（5.1±1.06）、（12.4±1.04）、（5.3±0.97）個(gè)，產(chǎn)蛋高峰期數(shù)量顯著高于其他2個(gè)時(shí)期（圖2B）。大白卵泡（BWF）在產(chǎn)蛋初期、產(chǎn)蛋高峰期、產(chǎn)蛋末期平均個(gè)數(shù)分別為（10.1±1.92）、（14.7±1.96）、（13.3±3.42）個(gè)（圖2C）。小白卵泡（SWF）在產(chǎn)蛋初期、產(chǎn)蛋末期平均個(gè)數(shù)分別為（27.6±3.42）、（42.1±6.88），產(chǎn)蛋高峰期數(shù)量過多難以準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)（圖2D）?？傊?，產(chǎn)蛋高峰期4種等級(jí)前卵泡的數(shù)量均呈現(xiàn)最高值，其中大黃卵泡和小白卵泡的平均個(gè)數(shù)差異顯著，大黃卵泡和大白卵泡的平均個(gè)數(shù)在產(chǎn)蛋期未達(dá)到顯著水平。

2.3原始和初級(jí)卵泡的組織學(xué)特征分析

對(duì)卵泡組織進(jìn)行切片和HE染色，對(duì)如皋黃雞卵巢中直徑小于1 mm的卵泡，即原始、初級(jí)和次級(jí)卵泡的形態(tài)和大小進(jìn)行了顯微鏡觀察和統(tǒng)計(jì)。由圖3可知，原始卵泡中，卵母細(xì)胞外圍繞一層不規(guī)則、松散排列的扁平狀顆粒細(xì)胞（圖3A）;初級(jí)卵泡中，卵母細(xì)胞外圍繞一層規(guī)則、緊密排列的立方狀顆粒細(xì)胞（圖3B）;次級(jí)卵泡中，卵母細(xì)胞外圍繞兩層以上規(guī)則、緊密排列的扁平顆粒細(xì)胞（圖3C）。對(duì)不同產(chǎn)蛋時(shí)期初級(jí)卵泡的直徑統(tǒng)計(jì)顯示，初級(jí)卵泡平均直徑為（42.3±1.4）μm，而在不同產(chǎn)蛋時(shí)期，卵巢中可見的初級(jí)卵泡大小略有不同，預(yù)產(chǎn)期、產(chǎn)蛋初期、產(chǎn)蛋高峰期和產(chǎn)蛋末期分別為（45.27±2.39）、（50.46±1.05）、（30.03±1.53）和（40.30±1.35）μm，其中產(chǎn)蛋初期卵巢中的初級(jí)卵泡平均直徑最大，產(chǎn)蛋高峰期平均直徑最小，均與另外兩個(gè)時(shí)期差異顯著（圖4）。

2.4不同產(chǎn)蛋時(shí)期卵巢次級(jí)卵泡數(shù)量變化分析

為了解次級(jí)卵泡在不同產(chǎn)蛋時(shí)期的數(shù)量變化，選取每個(gè)卵巢與卵系膜平行的組織切片，對(duì)直徑在1 mm以下的次級(jí)卵泡進(jìn)行了相對(duì)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)。將次級(jí)卵泡直徑（圖5A～D）由大到小分為400～1000、200～400、100～200和50～100 μm 4個(gè)小組分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由圖5可知，次級(jí)卵泡數(shù)量均在預(yù)產(chǎn)期較高，產(chǎn)蛋初期4個(gè)尺寸的次級(jí)卵泡數(shù)量均顯著下降。隨著產(chǎn)蛋期的推進(jìn)，直徑400～1 000 μm的次級(jí)卵泡在產(chǎn)蛋高峰期數(shù)量最少，在產(chǎn)蛋末期有所上升;直徑200～400 μm的次級(jí)卵泡在整個(gè)產(chǎn)蛋周期變化不顯著;直徑100～200 μm組的次級(jí)卵泡在產(chǎn)蛋周期中逐漸增多，在產(chǎn)蛋末期數(shù)量最多;而直徑50～100 μm組的次級(jí)卵泡數(shù)量在產(chǎn)蛋周期中逐漸減少，在產(chǎn)蛋末期數(shù)量最低。D765F16B-4BFE-414D-9135-AE9A51FC7318

3討論與結(jié)論

雞輸卵管發(fā)生一般被分為3個(gè)階段，第1階段是1～8周齡的發(fā)育停滯期，第2階段是9～17周齡的緩慢發(fā)育期，第3階段是18～21周的快速發(fā)育期[12]，劉龍等[13]根據(jù)輸卵管黏膜上皮細(xì)胞的發(fā)育情況將第13周齡、16周齡、17周齡和20周齡進(jìn)一步定義為細(xì)胞增殖前期、細(xì)胞增殖后期、細(xì)胞分化前期和產(chǎn)蛋期，并證明了幾個(gè)時(shí)期間具有差異性的基因表達(dá)譜。本研究進(jìn)一步從大體水平探索了產(chǎn)蛋期的輸卵管變化，從外觀上看，輸卵管在產(chǎn)蛋周期內(nèi)持續(xù)發(fā)育，其長(zhǎng)度在產(chǎn)蛋初期到末期見變化顯著而增幅較小，但重量有較大幅度大增加，可見其發(fā)育主要體現(xiàn)在厚度，即輸卵管黏膜上皮的柱狀纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞的增多上[14]。

不同產(chǎn)蛋時(shí)期的卵巢總重量（不含等級(jí)卵泡）隨產(chǎn)蛋時(shí)期明顯增加，從外觀上看卵泡系帶、卵巢間質(zhì)結(jié)締組織均隨著產(chǎn)蛋期進(jìn)展而增粗或增厚，對(duì)卵巢重量產(chǎn)生了一定影響[15]。此外，等級(jí)前卵泡的分離和統(tǒng)計(jì)顯示，小黃卵泡、小白卵泡數(shù)量在產(chǎn)蛋高峰期呈現(xiàn)出最高值（由于產(chǎn)蛋高峰期小白卵泡數(shù)量過多，難以進(jìn)行準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)，因此未提供數(shù)值），大黃、大白卵泡在初期和高峰期間有上升趨勢(shì)，但由于組內(nèi)個(gè)體差異較大，沒有達(dá)到顯著差異。從趨勢(shì)上看，各時(shí)期等級(jí)前卵泡均在高峰期呈現(xiàn)最高值，可見等級(jí)前卵泡的數(shù)量與個(gè)體產(chǎn)蛋能力有直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

根據(jù)切片觀察顯示，原始、初級(jí)、次級(jí)卵泡組織學(xué)差異顯著，且原始、初級(jí)卵泡數(shù)量極多。本研究首次測(cè)量統(tǒng)計(jì)了不同產(chǎn)蛋期初級(jí)卵泡的直徑大小，并發(fā)現(xiàn)卵巢中的初級(jí)卵泡直徑隨產(chǎn)蛋時(shí)期略有變化，產(chǎn)蛋初期最高而高峰期最低，這一變化提示產(chǎn)蛋初期初級(jí)卵泡的儲(chǔ)備豐富，而高峰期大量初級(jí)卵泡進(jìn)入次級(jí)階段發(fā)育或經(jīng)歷了閉鎖[16-17]。此外，次級(jí)卵泡的總數(shù)量在預(yù)產(chǎn)期（16周、112日齡）最高，進(jìn)入產(chǎn)蛋周期后顯著下降，這與海蘭褐雞生長(zhǎng)發(fā)育過程（63、100、281、481日齡）中卵泡數(shù)量的研究中提出的，次級(jí)卵泡數(shù)在100日齡時(shí)達(dá)最高點(diǎn)一致[18]。值得注意的是，觀察測(cè)量顯示次級(jí)卵泡直徑變化跨度較大（50～1000 μm），因此首次對(duì)次級(jí)卵泡進(jìn)行了分段統(tǒng)計(jì)。而結(jié)果提示不同大小的次級(jí)卵泡變化有所差異，尤其直徑100～200 μm的次級(jí)卵泡，在不同產(chǎn)蛋時(shí)期變化規(guī)律與其他直徑的次級(jí)卵泡截然不同。

綜上，本研究從大體和組織學(xué)角度比較了預(yù)產(chǎn)期、產(chǎn)蛋初期、產(chǎn)蛋高峰期和產(chǎn)蛋末期如皋黃雞卵巢及卵泡數(shù)量變化，尤其對(duì)次級(jí)卵泡變化規(guī)律進(jìn)行了探討，為卵泡發(fā)育規(guī)律和機(jī)制研究及產(chǎn)蛋性能改善研究提供了參考。

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收稿日期：2022-03-20

作者簡(jiǎn)介：丁悅，女，2001年生，本科在讀，主要從事畜牧學(xué)方面研究。

*通信作者：張金璧，女，1985年生，副教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究（E-mail：zhangjinbi@jit.edu.cn）。

基金項(xiàng)目：江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（202113573016Z）;金陵科技學(xué)院“科教融合項(xiàng)目”（2021KJRH33）。D765F16B-4BFE-414D-9135-AE9A51FC7318