新型手性殺蟲劑唑蟲酯異構(gòu)體拆分及其在蔬菜中的分析方法建立

陳 炎, 黃聰靈, 江薰垣, 陳志廷, 王 剛, 萬 凱, 唐雪妹

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室,廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估重點實驗室, 國家農(nóng)業(yè)檢測基準(zhǔn)實驗室(農(nóng)藥殘留), 廣東 廣州 510000)

在我國銷售的化學(xué)農(nóng)藥中,手性農(nóng)藥在市場中占比達(dá)到40%,占據(jù)重要地位[1,2]。手性農(nóng)藥不同對映體在環(huán)境行為、生物活性、毒性等方面往往存在差異[3-5],而在評估手性農(nóng)藥對非靶標(biāo)生物和生態(tài)環(huán)境造成的實際危害時,沒有區(qū)分手性異構(gòu)體差別,評估結(jié)果不夠準(zhǔn)確和全面[6-9]。因此,手性拆分是研究手性農(nóng)藥毒理毒性和環(huán)境選擇性行為的前提和基礎(chǔ)[10-12]。

目前最廣泛使用的手性農(nóng)藥對映體拆分分析方法是色譜法,其中常見的色譜法包括:氣相色譜法、液相色譜法、超臨界流體色譜法等[13,14]。而液相色譜法隨著QuEChERS前處理方法的普及,具有分析時間較短、分離效率高等優(yōu)點,適用更廣泛[15-18]。Li等[19]利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS)同時分離甲霜靈等6種手性殺菌劑,分離度在1.38～3.46之間。齊艷麗等[20]建立了手性超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測小麥及其加工制品中腈菌唑?qū)τ丑w殘留的分析方法。黃玉芬等[21]采用優(yōu)化的QuEChERS樣品前處理技術(shù)和HPLC-MS/MS,建立了同時測定土壤中3種手性殺菌劑對映體的分離分析方法。

唑蟲酯(pyraquinil, Pyr)是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)徐漢虹課題組研發(fā)的一種具有吡唑并[1,5-a]喹唑啉稠合雜環(huán)骨架的全新手性殺蟲劑,含有兩個手性中心,4個手性異構(gòu)體(見圖1)。因其對抗性品系小菜蛾具有良好的防治效果[22-25],且其在靶標(biāo)上的作用位點有別于現(xiàn)有氨基丁酸(GABA)受體抑制劑殺蟲劑,如狄氏劑、氟蟲腈、阿維菌素等[22],唑蟲酯有望成為防治小菜蛾的主要輪換品種,具有廣闊的市場前景。

圖 1 唑蟲酯及其氧化代謝產(chǎn)物異構(gòu)體的絕對構(gòu)型Fig. 1 Absolute configurations of pyraquinil (Pyr) and its oxidation products (Pyr+O)

目前關(guān)于唑蟲酯的相關(guān)研究都是基于外消旋體來進(jìn)行的,并未區(qū)分手性對映體的區(qū)別,因此有必要建立唑蟲酯對映體分離分析方法。鑒于此,本工作利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜,對唑蟲酯及唑蟲酯氧化代謝產(chǎn)物(Pyr+O)異構(gòu)體進(jìn)行手性拆分,并確定各異構(gòu)體在色譜柱上的流出順序。同時,建立了唑蟲酯及唑蟲酯氧化代謝產(chǎn)物異構(gòu)體在蔬菜中的殘留分析方法。旨在為開發(fā)和使用高效低毒的唑蟲酯手性單體提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為指導(dǎo)新農(nóng)藥的合理使用提供技術(shù)支撐,為對其環(huán)境行為研究、后續(xù)質(zhì)量控制及藥效評價等提供相應(yīng)的分析技術(shù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LCMS-8060高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津儀器有限公司); QuEChERS自動樣品制備系統(tǒng)(Sio-6512,北京本立科技有限公司);超純水儀(Milli-Q,美國密理博公司);電子天平(EM204,梅特勒-托利多儀器有限公司);超聲波清洗器(KQ-800KDE,昆山超聲儀器有限公司);旋渦混合器(GL-88B,其林貝爾儀器制造有限公司)。

唑蟲酯(純度98%)及其氧化產(chǎn)物原藥,來源于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室;甲醇、乙腈(色譜純,德國默克集團(tuán));微孔濾膜(0.22 μm,天津津騰實驗設(shè)備有限公司);甲酸銨(純度≥99%,上海阿拉丁生化科技有限公司)。石墨化炭黑(GCB)和N-丙基乙二胺固相吸附劑(PSA)(200～400目,博納艾杰爾科技);無水硫酸鎂(分析純,廣州化學(xué)試劑廠)。

供試小白菜和蕹菜品種分別為甜脆小白菜8933和青梗柳葉空心菜,均采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地。

1.2 樣品提取與凈化

稱取10 g(精確至0.01 g)蔬菜樣品置于50 mL離心管中,加入20 mL乙腈,并加入研磨珠,渦旋振蕩30 s;再加入1.0 g氯化鈉、4.0 g無水硫酸鎂渦旋混勻,離心振蕩一體機(jī)以1 000 r/min速度振蕩5 min,以4 000 r/min速度離心5 min。取8.0 mL上清液于裝有1.0 g凈化劑(0.835 g MgSO4+0.150 g PSA+0.015 g GCB)的離心管中,以1 000 r/min速度振蕩2 min,以4 000 r/min速度離心2 min,取上清液,過0.22 μm的有機(jī)濾膜,待測。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別稱取250.0 mg外消旋唑蟲酯和氧化產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品至250 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解,配制成1 000 mg/L的母液。將上述母液用乙腈逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、5、10、50、100、500和2 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液備用。稱取空白樣品,按1.2節(jié)的方法前處理后,獲得空白基質(zhì)液,分別用基質(zhì)配制質(zhì)量濃度為5、10、50、100、500、1 000和5 000 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積平均值(Y)與標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(X, μg/L)進(jìn)行線性回歸,繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1色譜條件

纖維素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)共價鍵鍵合手性色譜柱(Chiral INC, 250 mm×4.6 mm, 5 μm,購自廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司);流動相A相為2 mmol/L甲酸銨水溶液,B相為乙腈。梯度洗脫程序:0～2.5 min, 43%B; 2.5～57 min, 43%B～46%B; 57～58 min, 46%B～43%B; 58～60 min, 43%B。柱溫:28 ℃;進(jìn)樣量:1 μL;流速:0.5 mL/min。

1.4.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子掃描;加熱模塊溫度:400 ℃;脫溶劑溫度:250 ℃;霧化氣流量:3.0 L/min;干燥氣流量:10 L/min;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);駐留時間:0.03 s。其他參數(shù)見表1。

表 1 唑蟲酯及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of Pyr and its metabolites

1.5 數(shù)據(jù)處理

1.5.1分離度計算

分離度(Rs)的計算方法見公式(1):

(1)

其中,t為保留時間,w為峰寬。

1.5.2基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effects, ME)是指共流出物影響分析物的離子化效率,使其分析信號增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象。計算基質(zhì)效應(yīng)的公式如下:

(2)

其中,k2代表基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,k1代表溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)ME為正值時為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),當(dāng)ME為負(fù)值時為基質(zhì)減弱效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)在-20%～20%之間為弱基質(zhì)效應(yīng);在-50%～-20%和20%～50%之間為中等基質(zhì)效應(yīng);超過-50%或50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[26]。

2 結(jié)果與討論

2.1 唑蟲酯異構(gòu)體拆分條件優(yōu)化

2.1.1不同手性固定相對唑蟲酯異構(gòu)體分離的影響

手性柱中的固定相對化合物的手性分離往往起決定性作用。目前市場上用于色譜分離的手性固定相大致分為多糖(cellulose)型、環(huán)糊精(cyclodextrin)型、大環(huán)抗生素(macrocyclic antibiotics)型、蛋白質(zhì)(protein)型以及冠醚(crown enters)型等。其中,多糖型是商品化手性固定相中應(yīng)用最廣泛的類型之一,包括纖維素型和淀粉型[27]。多糖是一類具有天然光學(xué)活性的高分子化合物,其葡萄糖單元上的羥基易于被修飾和衍生化,表現(xiàn)出特殊的手性識別能力[28]。因此本研究選擇6種多糖型的手性柱,在日本島津LC-20A高效液相色譜儀上比較了不同手性柱對唑蟲酯異構(gòu)體的分離效果。6種手性分離色譜柱:直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(Chiral ND(2)-RH)、直鏈淀粉-三(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)(Chiral NY(2)-RH)、直鏈淀粉-三(4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯)(Chiral NX(2)-RH)、纖維素-三(4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯)(Chiral MX(2)-RH)、纖維素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)共價鍵鍵合(Chiral INC)和纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)共價鍵鍵合(Chiral INB);以上手性柱均購自廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司,規(guī)格為250 mm×4.6 mm, 5 μm。

結(jié)果如圖2所示,在所測試的手性固定相中,Chiral ND(2)-RH柱無法分離唑蟲酯異構(gòu)體,Chiral NY(2)-RH柱和Chiral NX(2)-RH柱只能分離出2種異構(gòu)體,Chiral MX(2)-RH可分離3種異構(gòu)體,Chiral INB柱未能完全分離4種異構(gòu)體,而Chiral INC手性柱成功實現(xiàn)了唑蟲酯4個異構(gòu)體的基線分離,表現(xiàn)出最佳的拆分性能。

圖 2 不同手性柱分離唑蟲酯異構(gòu)體的色譜圖Fig. 2 Chiral separation chromatograms of Pyr enantiomers by different chiral columns

另外,根據(jù)文獻(xiàn)報道,纖維素類手性柱與直鏈淀粉類手性柱的手性識別能力存在很大差別,且纖維素類手性柱的穩(wěn)定性更高[27],鍵合型纖維素類手性固定相可以通過流動相的優(yōu)化來實現(xiàn)很多在常規(guī)流動相中難以分離的對映體的拆分[28]。綜合考慮,本工作選擇鍵合型纖維素類固定相的Chiral INC手性柱作為唑蟲酯異構(gòu)體的拆分柱。

2.1.2流動相比例對唑蟲酯及其氧化產(chǎn)物異構(gòu)體分離的影響

流動相的選擇和優(yōu)化對于目標(biāo)物質(zhì)的分離起著至關(guān)重要的作用,本工作以2 mmol/L甲酸銨水溶液和乙腈為流動相,設(shè)置6個洗脫程序,分別計算不同洗脫條件下唑蟲酯及其氧化產(chǎn)物異構(gòu)體兩個色譜峰之間的分離度(見表2),比較不同流動相比例下唑蟲酯及其氧化產(chǎn)物的拆分效果。

從表2可知,唑蟲酯及氧化產(chǎn)物異構(gòu)體分離度隨有機(jī)相初始比例的提高而變大,同時受提高速度的影響,提高速度越慢,分離度越大。在洗脫程序1～3條件下,唑蟲酯各異構(gòu)體之間分離度為0.53～2.10,氧化產(chǎn)物分離度為2.93～3.97;洗脫程序4～6 條件下,唑蟲酯各異構(gòu)體之間的分離度為1.62～ 2.83。通常,當(dāng)分離度高于1.5時就認(rèn)為各色譜峰之間實現(xiàn)了基線分離。

表 2 不同洗脫條件下唑蟲酯及其氧化產(chǎn)物異構(gòu)體的分離度Table 2 Resolutions (Rs) of Pyr and Pyr+O enantiomers under different elution conditions

因此,洗脫程序1～3條件下,目標(biāo)物質(zhì)的各異構(gòu)體之間難以完全分離;洗脫程序4～6條件下,目標(biāo)物質(zhì)的各異構(gòu)體之間實現(xiàn)基線分離。由于在洗脫程序6條件下完全分離所需分析時間為60 min,短于洗脫程序4～5條件下完全分離所需分析時間70 min,綜合考慮唑蟲酯異構(gòu)體分離參數(shù)(分離度高和分析時間短),本研究確定洗脫程序6(即1.4.1節(jié)梯度程序)為唑蟲酯及其氧化產(chǎn)物異構(gòu)體在HPLC-MS/MS上的最佳分離條件,如圖3所示,唑蟲酯4個異構(gòu)體和氧化產(chǎn)物2個異構(gòu)體均得到完全分離。

圖 3 采用表2中洗脫程序6時唑蟲酯及唑蟲酯氧化產(chǎn)物 的分離色譜圖Fig. 3 Chromatogram of the separation of Pyr and its oxidation products under elution condition 6 in Table 2 The Chiral column: Chiral INC (250 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase A: 2 mmol/L ammonium formate aqueous solution; mobile phase B: acetonitrile; column temperature: 28 ℃; injection volume: 1 μL; flow rate: 0.5 mL/min; elution program: 0-2.5 min, 43%B; 2.5-57 min, 43%B-46%B; 57-58 min, 46%B-43%B; 58-60 min, 43%B. Peak identifications: 1-4. four chiral isomers of pyraquinil; 5, 6. two chiral isomers of oxidation products.

2.1.3唑蟲酯及其氧化產(chǎn)物手性異構(gòu)體的出峰順序

前期通過對唑蟲酯4個手性異構(gòu)單體進(jìn)行單晶培養(yǎng),確認(rèn)了RS、SR手性異構(gòu)體的絕對構(gòu)型。本研究對唑蟲酯4個手性異構(gòu)體進(jìn)行衍生化,可以得知RS-Pyr和SS-Pyr氧化之后將得到相同的產(chǎn)物,即S-(Pyr+O),而RR-Pyr和SR-Pyr氧化之后將得到相同的產(chǎn)物,即R-(Pyr+O)。因此對單晶結(jié)果確認(rèn)的RS、SR手性異構(gòu)體氧化之后分別純化,獲得了S型和R型唑蟲酯氧化產(chǎn)物的兩個手性單體的色譜圖(見圖4b, 4e),兩個手性單體的出峰順序為S-(Pyr+O)、R-(Pyr+O),如圖4a所示。再根據(jù)確認(rèn)的S型和R型唑蟲酯氧化產(chǎn)物反向確認(rèn)SS-Pyr和RR-Pyr,如圖4c和4d。

圖 4 唑蟲酯及唑蟲酯氧化產(chǎn)物異構(gòu)體在手性柱Chiral INC上的出峰順序Fig. 4 Peak order of stereoisomers of Pyr and Pyr+O on Chiral INC column a-e represent the chromatogram of the Pyr and Pyr+O, RS-Pyr and S-(Pyr+O), SS-Pyr and S-(Pyr+O), RR-Pyr and R-(Pyr+O), and SR-Pyr and R-(Pyr+O), respectively.

綜上所述,唑蟲酯4個手性異構(gòu)體依次出峰順序為RS-Pyr、SS-Pyr、RR-Pyr和SR-Pyr;唑蟲酯氧化產(chǎn)物異構(gòu)體出峰順序為S-(Pyr+O)和R-(Pyr+O)(見圖4a)。

2.2 前處理凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS前處理法是目前廣泛應(yīng)用的前處理方法[29]。鑒于此,本研究參考GB 23200.113-2018中蔬菜的QuEChERS前處理方法,綜合比較3種不同組合(0.850 g MgSO4+0.150 g PSA、0.985 g MgSO4+0.015 g GCB和0.835 g MgSO4+0.150 g PSA+0.015 g GCB)的凈化劑對唑蟲酯及其氧化產(chǎn)物不同異構(gòu)體在蔬菜中回收率的影響(見圖5)。由圖5可以看出,對于唑蟲酯及其氧化產(chǎn)物6個異構(gòu)體而言,0.850 g MgSO4+0.150 g PSA和0.835 g MgSO4+0.150 g PSA+0.015 g GCB為凈化劑時,回收率在80%～110%之間;0.985 g MgSO4+0.015 g GCB為凈化劑時,在蕹菜中,R-(Pyr+O)和S-(Pyr+O)的回收率小于80%,在小白菜中唑蟲酯及其氧化產(chǎn)物6個異構(gòu)體回收率均大于110%。由于GCB主要對色素具有一定的吸附作用,蕹菜和小白菜屬于顏色較深的蔬菜,因此綜合考慮,選擇0.835 g MgSO4+0.150 g PSA+0.015 g GCB作為最優(yōu)凈化劑組合。

圖 5 唑蟲酯及其氧化產(chǎn)物異構(gòu)體在(a)蕹菜和(b)小白菜中的回收率(n=3)Fig. 5 Recoveries of Pyr and Pyr+O enantiomers in (a) water spinach (Ipomoea aquatica Forsk) and (b) pakchoi (Brassica rapa ssp. chinensis L.) (n=3) Combinations of purifiers: A. 0.85 g MgSO4+0.150 g PSA; B. 0.985 g MgSO4+0.015 g GCB; C. 0.835 g MgSO4+0.150 g PSA+0.015 g GCB.

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1基質(zhì)效應(yīng)

本研究采用公式(2)的方法評價唑蟲酯及其氧化代謝產(chǎn)物異構(gòu)體在不同蔬菜中的ME。從表3可看出,唑蟲酯及其氧化代謝產(chǎn)物異構(gòu)體的ME在0.7%～30.6%之間,均為正值。因此在蕹菜和小白菜中均表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。其中SS-Pyr、RR-Pyr、R-(Pyr+O)和S-(Pyr+O)在小白菜和蕹菜中均表現(xiàn)出弱基質(zhì)效應(yīng);RS-Pyr在小白菜中表現(xiàn)出弱基質(zhì)效應(yīng),在蕹菜中表現(xiàn)出中等基質(zhì)效應(yīng);SR-Pyr在蕹菜和小白菜中表現(xiàn)出中等基質(zhì)效應(yīng)。由于不同異構(gòu)體在不同基質(zhì)中的ME大小不一,本工作為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性,采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液為基準(zhǔn)進(jìn)行校正。

表 3 唑蟲酯及其氧化產(chǎn)物異構(gòu)體的線性關(guān)系和基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Linear relationships and matrix effects of Pyr and Pyr+O enantiomers

2.3.2線性范圍和定量限

當(dāng)唑蟲酯的手性異構(gòu)體質(zhì)量濃度在1.25～1 250 μg/L之間及唑蟲酯氧化代謝產(chǎn)物手性異構(gòu)體質(zhì)量濃度在2.5～2 500 μg/L之間時,基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積與對應(yīng)質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)如表3所示。以滿足農(nóng)殘分析回收率要求的最低加標(biāo)水平為方法定量限(LOQ),唑蟲酯異構(gòu)體的LOQ為0.25 μg/kg,唑蟲酯氧化代謝產(chǎn)物手性異構(gòu)體的LOQ為0.5 μg/kg。

2.3.3準(zhǔn)確度和精密度

在蕹菜和小白菜樣品中同時添加唑蟲酯和唑蟲酯氧化產(chǎn)物消旋體進(jìn)行添加回收試驗,添加水平為1、20、400 μg/kg,此時樣品中唑蟲酯異構(gòu)體對應(yīng)添加水平為0.25、5、100 μg/kg,唑蟲酯氧化代謝產(chǎn)物異構(gòu)體對應(yīng)添加水平為0.5、10、200 μg/kg,在3天內(nèi)每天添加一次,每個水平做3個平行,按本文方法進(jìn)行測定。通過比較同一天內(nèi)目標(biāo)物加標(biāo)回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來考察日內(nèi)重復(fù)性,通過分析3天內(nèi)目標(biāo)物回收率的RSD來考察日間重復(fù)性。

由表4可知,蕹菜中3個加標(biāo)水平下該方法的平均回收率為72.6%～109.9%,日內(nèi)重復(fù)性RSD為0.5%～8.7%;日間重復(fù)性RSD為1.0%～8.6%。由表5可知,小白菜中3個加標(biāo)水平下該方法的平均 回收率為81.2%～110.6%,日內(nèi)RSD為0.6%～8.3%;日間RSD為1.1%～7.6%。實驗結(jié)果表明,該方法的回收率和精密度符合定量分析要求,適用于蕹菜和小白菜中唑蟲酯及其氧化產(chǎn)物異構(gòu)體的分析。

表4 唑蟲酯及氧化產(chǎn)物異構(gòu)體在蕹菜中的加標(biāo)回收率Table 4 Spiked recoveries of Pyr and Pyr+O enantiomers in water spinach

表 4 (續(xù))Table 4 (Continued)

表 5 唑蟲酯及氧化產(chǎn)物異構(gòu)體在小白菜中的加標(biāo)回收率Table 5 Spiked recoveries of Pyr and Pyr+O enantiomers in pakchoi

3 結(jié)論

通過對影響高效液相色譜分離分析的主要因素反相手性色譜柱和流動相等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,在高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上建立了拆分唑蟲酯及其氧化代謝產(chǎn)物異構(gòu)體的方法,并建立了蕹菜和小白菜中殘留分析的方法,方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足農(nóng)殘檢測要求;同時利用衍生化的方法確定了唑蟲酯以及唑蟲酯氧化代謝產(chǎn)物異構(gòu)體的出峰順序,在Chiral INC反相色譜柱上的出峰順序依次為RS-、SS-、RR-、SR-唑蟲酯、S-和R-唑蟲酯氧化產(chǎn)物。本研究可為新型手性農(nóng)藥唑蟲酯的環(huán)境選擇性行為研究、質(zhì)量控制及藥效評價等方面提供相應(yīng)技術(shù)支持,同時也為新農(nóng)藥開發(fā)及應(yīng)用提供有力的理論支撐。