細(xì)辛多糖提純、保潤和熱裂解產(chǎn)物研究及應(yīng)用

張皓楠，金桂勇，席高磊，杜佳，張曉平，劉鵬飛，王小莉

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南中煙工業(yè)公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450016；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

保潤劑是一類具有較強(qiáng)從環(huán)境中吸收水分和保持水分能力的物質(zhì)，在煙草、食品等方面均有廣泛應(yīng)用[1]。煙草保潤劑從煙葉采收、運(yùn)輸、貯存及整個生產(chǎn)銷售過程中可以有效地保持煙葉水分，對煙葉破碎、霉變、減少煙氣刺激性、增加煙氣舒適感等方面起著重要作用[2]。煙草領(lǐng)域傳統(tǒng)保潤劑甘油、丙二醇等在卷煙燃吸時會形成焦油、苯酚等致癌物質(zhì)，同時會產(chǎn)生一定的刺激性[3]、干燥感[4]。因此，尋找高效且能夠改善卷煙品質(zhì)的新型煙草保潤劑成為行業(yè)發(fā)展的重要課題。近年來，天然多糖在煙草保潤方面的應(yīng)用成為了研究的熱點。

多糖是由多種單糖聚合成的天然高分子化合物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其具有保潤、吸濕、降糖、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、抗氧化等重要生物活性[5-6]。此外，多糖中含有大量的羥基等親水基團(tuán)，可與水分子緊密結(jié)合，對煙草具有較好的保潤作用；同時，多糖在高溫條件下裂解可以產(chǎn)生大量對煙氣有益的有機(jī)物，可以起到一定的增香效果[7-8]。如李永齊等[9]對比了白鬼筆菌托(Phallusimpudicus)多糖、銀耳(Tremellafuciformis)多糖、蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)多糖、花臉香蘑(Lepistasordida)多糖和蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyceshepiali)多糖保潤效果，保濕性均低于甘油，防潮效果均高于甘油，其中白鬼筆菌托多糖具有較好的保濕性能和較好的防潮效果；黃芳芳等[10]分別提取了銅藻(Sargassumhorneri)多糖水提物、醇提物、徑向流色譜脫蛋白提取物、化學(xué)法脫蛋白提取物并添加至煙絲中，測得銅藻多糖在低濕和高濕條件下均可減緩煙絲水分的變化，熱裂解產(chǎn)物識別出糠醛類、酮類等物質(zhì)，使得添加銅藻多糖后的卷煙品質(zhì)上升，證明了銅藻多糖是一種天然保潤劑；劉珊等[11]通過熱裂解產(chǎn)物研究裙帶菜(Undariapinnatifida)多糖對卷煙感官質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)加入裙帶菜多糖后的卷煙雜氣降低，刺激性降低，煙氣細(xì)膩度提高，回甜舒適感增強(qiáng)。目前，多糖對卷煙保潤增香研究多只考察其保潤性或熱裂解產(chǎn)物，多糖的保潤性、熱裂解產(chǎn)物及其添加至卷煙中的評吸評價相關(guān)研究較少。

因此，本研究選用北細(xì)辛(AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum (Maxim.)Kitag.，簡稱Asarum)作為研究對象，對其進(jìn)行提取、脫蛋白、分離純化，通過紫外-可見光譜、紅外光譜、掃描電鏡對分離純化組分進(jìn)行鑒定；通過將其噴施于煙絲考察其對煙絲的保潤性，并分析其熱裂解產(chǎn)物卷煙評吸評價，以期為細(xì)辛多糖在卷煙中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細(xì)辛：市購北細(xì)辛；無水乙醇(C2H6O)、濃硫酸(H2SO4)(煙臺市雙雙化工有限公司，AR)；氯化鈉(NaCl)、氫氧化鈉(NaOH)、苯酚(C6H6O)、甘油(C3H8O3)(天津市大茂化學(xué)試劑廠，AR)；溴化鉀KBr(天津市大茂化學(xué)試劑廠，GR)；DEAE-52(北京索萊寶科技有限公司，AR)。

BSZ-160F自動部分收集器，上海之信儀器有限公司；UV-5200紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀，Thermo Nicolet Co；S-3400掃描電鏡，Hitachi Limited；5250-T熱裂解儀，CDS Analytical；Agilent 7890B-5977A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent Technologies。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)辛粗多糖的制備 細(xì)辛粗多糖ASPs的制備采用水提醇沉法。取細(xì)辛干品(過0.3 mm孔徑篩)，m(料/g)∶V(液/L)=1∶0.01，提取溫度為60 ℃，提取時間1 h，提取3次合并提取液并濃縮，離心去沉淀后加入無水乙醇至V(提取液)∶V(乙醇)=1∶3，4 ℃環(huán)境下醇沉過夜，離心后取沉淀物，沉淀物用適量水復(fù)溶后，用截留相對分子質(zhì)量為3 500 Da的透析袋透析72 h。透析后多糖水溶液冷凍干燥即得細(xì)辛粗多糖。

1.2.2 細(xì)辛粗多糖的分離純化 細(xì)辛粗多糖的分離純化，先使用Sevag法脫蛋白3次，再通過DEAE-52纖維素層析柱(16 mm×470 mm)進(jìn)一步分離純化，參考文獻(xiàn)[12-13]的方法進(jìn)行。

1.2.3 細(xì)辛多糖的紫外掃描 稱取細(xì)辛多糖用水配置成質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1的溶液，使用紫外-可見分光光度計在190～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.4 細(xì)辛多糖的紅外光譜 稱取0.002 g細(xì)辛多糖和0.1 g溴化鉀粉末混合，在干燥干凈的瑪瑙研缽中研磨均勻，烘干后用壓片機(jī)壓片。用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～500 cm-1的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.5 細(xì)辛多糖掃描電子顯微鏡 采用掃描電鏡觀察細(xì)辛多糖的微觀表面形貌。

1.2.6 細(xì)辛多糖煙草保潤性分析 參考王小莉[13]的方法，選用云煙97等級C3F的單料煙絲，將煙絲置于溫度為22 ℃、濕度為60%的條件下平衡水分48 h。稱取5組10 g煙絲，對每組分別噴施1 mL配置好的0.1 g·L-1的ASP1、ASP2、ASP3和質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1的甘油，噴施純水為對照；將處理后的煙絲上述條件下再平衡水分48 h，備用。

保濕性試驗：取上述處理后的煙絲，每組分為3份。置于22 ℃、相對濕度為40%的恒溫恒濕箱中保持低濕條件，0、6、12、24、36、48、72、96、120 h定時稱量煙絲質(zhì)量。烘箱烘干后稱其干質(zhì)量，按以下公式計算含水率(W)。

式中：m0為某時間點煙絲樣品的質(zhì)量/g；m為煙絲樣品的干質(zhì)量/g。

吸濕性試驗：同上操作，將煙絲置于溫度22 ℃，相對濕度70%的恒溫恒濕箱中保持高濕條件，記錄煙絲質(zhì)量隨時間的變化，按上述公式計算含水率。

1.2.7 細(xì)辛多糖熱裂解產(chǎn)物分析 按照張翼飛等[14]的方法，取適量干燥的多糖樣品放入石英管中，用石英棉堵住兩端，隨后將石英管放入熱裂解儀中，選用300、600和900 ℃，在氦氣氣氛中進(jìn)行無氧裂解試驗。

1.2.8 感官評吸質(zhì)量評價 參考劉珊等[11]的方法，選用糖含量最高的組分ASP3添加至單料煙絲。煙絲先在溫度22 ℃，相對濕度60%的恒溫恒濕箱中平衡水分48 h，多糖用純水稀釋后按0.2、0.4、0.6、0.8 g·kg-1添加至煙絲，以添加純水為對照(CK)。添加后再平衡水分48 h。手工卷制后進(jìn)行感官評吸評價，采用“九分制”對10個指標(biāo)進(jìn)行打分。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)辛粗多糖的分離純化

DEAE-52纖維素層析柱為陰離子交換柱，使用不同濃度的NaCl溶液洗脫，可以根據(jù)所帶電荷的強(qiáng)弱將樣品分離成不同組分。由圖1可知，細(xì)辛粗多糖經(jīng)0、0.2、0.3 mol·L-1的NaCl洗脫得到3個多糖組分，將其命名為ASP1、ASP2、ASP3。3個組分吸光值存在差異，ASP3的吸光值相對較高，說明了其糖含量較高；3個組分峰型均較窄，無明顯拖尾，純度較高。

圖1 細(xì)辛多糖的DEAE-52纖維素柱洗脫曲線Fig.1 Elution curve of ASPs on DEAE-52 cellulose column

2.2 細(xì)辛多糖的紫外全波長掃描

圖2為細(xì)辛多糖分離純化后的3個組分及細(xì)辛粗多糖的紫外掃描光譜圖。對ASP1、ASP2、ASP3和細(xì)辛粗多糖在190～500 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行了紫外掃描。檢測其在260、280 nm波長處是否含有核酸和蛋白質(zhì)綴合物吸收峰[15]。從圖2中可以看出，細(xì)辛多糖均為末端吸收，細(xì)辛粗多糖在260～280 nm處存在吸收峰，而3個組分在260和280 nm處均無明顯的紫外吸收。3個組分與碘反應(yīng)未變藍(lán)，說明均為非淀粉。

圖2 細(xì)辛多糖的紫外全波長吸收光譜Fig.2 UV full-wavelength absorption spectrum of ASPs

2.3 細(xì)辛多糖的紅外光譜

圖3 細(xì)辛多糖的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectrum of ASPs

2.4 細(xì)辛多糖掃描電子顯微鏡

圖4為ASP1、ASP2和ASP3在3 000倍條件下電子掃描顯微鏡圖，由圖可知ASP1表面粗糙，像干裂的土層，類似于海綿結(jié)構(gòu)，存在明顯孔洞及致密無孔區(qū)域；ASP2呈不規(guī)則絲狀，結(jié)構(gòu)疏松多孔；ASP3結(jié)構(gòu)較為致密，層次不一，呈無規(guī)則壓合片狀。

圖4 ASPs 掃描電子顯微鏡圖Fig.4 SEM of ASPs

2.5 細(xì)辛多糖在卷煙保潤性中的應(yīng)用

在低濕(相對濕度40%)條件下考察細(xì)辛多糖保濕性，噴施甘油、ASP1、ASP2、ASP3及純水的煙絲含水率隨時間變化(圖5)。由圖5可知，前24 h各處理煙絲含水率均下降較快，噴施ASP1、ASP2和ASP3的處理慢于噴施純水的對照處理快于甘油處理；24～48 h各處理含水率下降變慢；48 h后各處理含水率變化趨于穩(wěn)定。總體上ASP1、ASP2和ASP3保濕效果優(yōu)于對照，劣于甘油，其中細(xì)辛多糖分離組分保濕性ASP3>ASP1>ASP2。說明在干燥環(huán)境下，細(xì)辛多糖具有一定保濕性。

圖5 不同處理的煙絲在低濕條件下含水率隨時間的變化Fig.5 The change of moisture content of tobacco with time in low humidity conditions

在高濕(相對濕度70%)條件下考察細(xì)辛多糖吸濕性，噴施甘油、ASP1、ASP2、ASP3及純水的煙絲含水率隨時間變化如圖6所示。由圖6可知，前24 h各處理煙絲含水率均上升較快，24～48 h上升變慢；48 h后含水率變化趨于穩(wěn)定。趨于穩(wěn)定后，噴施ASP1、ASP2和ASP3處理的煙絲含水率低于甘油處理，且對照

圖6 不同處理的煙絲在高濕條件下含水率隨時間的變化Fig.6 The change of moisture content of tobacco with time in high humidity conditions

2.6 細(xì)辛多糖熱裂解產(chǎn)物分析

煙支在燃燒過程中發(fā)生著多種化學(xué)反應(yīng)，主要發(fā)生在燃燒錐區(qū)域，溫度一般為700～900 ℃，甚至可達(dá)1 000 ℃以上，該區(qū)域內(nèi)有機(jī)物在高溫缺氧環(huán)境下發(fā)生熱解、聚合等化學(xué)反應(yīng)；燃燒錐附近溫度為100～700 ℃[22-23]，因此本試驗選用代表性的300、600和900 ℃作為細(xì)辛多糖熱裂解研究溫度，并選用氦氣模擬無氧環(huán)境(表1)。

表1 不同溫度下ASP1、ASP2和ASP3的熱裂解產(chǎn)物Table 1 Pyrolysis products of ASP1,ASP2 and ASP3 at different temperatures %

在300 ℃時，由于溫度較低，ASP1裂解不充分，裂解產(chǎn)物很少。ASP1裂解產(chǎn)物僅有8種。其中主要有糠醛類含量為28.72%，酮類含量為1.35%；600 ℃下，裂解產(chǎn)物為27種，主要有糠醛類為26.81%，酮類5.05%，呋喃類6.32%，吡啶類1.8%；900 ℃下，裂解產(chǎn)物為36種，主要有糠醛類為21.63%，酮類9.88%，呋喃類6.56%，吡啶類1.88%。

與ASP1的熱裂解產(chǎn)物類似，在300 ℃下ASP2和ASP3的裂解產(chǎn)物很少，均只有7種。主要有糠醛類、酮類和呋喃類等，其中糠醛類含量分別為36.18%和23.27%，酮類含量分別為2.33%和1.29%；600 ℃下分別識別出31和36種，主要有糠醛類、酮類、呋喃類、吡啶類等，其中糠醛類含量分別為30.12%和13.12%、酮類含量分別為6.8%和20.62%、呋喃類含量分別為4.4%和3.48%、吡啶類含量分別為2.23%和1.55%；900 ℃下分別識別出37和41種，其中主要產(chǎn)物糠醛類含量分別為21.01%和8.32%、酮類含量分別為11.64%和21.77%、呋喃類含量分別為4.87%和4.95%、吡啶類含量分別為2.41%和2.05%。

綜上所述，不同溫度下ASP1、ASP2和ASP3的裂解產(chǎn)物存在一定差異，ASP1共產(chǎn)生44種、ASP2共46種、ASP3共47種，3個組分均產(chǎn)生了糠醛類、吡啶類、酚類、酯類等物質(zhì)。這些物質(zhì)對提高卷煙的香氣量、減輕雜氣等方面有較優(yōu)的作用。

2.7 細(xì)辛多糖在卷煙感官評吸質(zhì)量中的評價

對添加了不同添加量的細(xì)辛多糖的煙絲進(jìn)行感官評吸質(zhì)量評價(表2)。由表2可知，添加細(xì)辛多糖對卷煙香氣質(zhì)和香氣量有提升，同時雜氣有一定的減輕，香氣有改善；減少刺激，余味略有提升，甜味增加，口感改善；濃度和勁頭變化不大；燃燒性和灰分和CK相比，沒有變化。其中0.4和0.6 g·kg-1添加量的處理，評吸效果相對較好。

表2 添加細(xì)辛多糖煙葉感官質(zhì)量評價Table 2 Sensory quality evaluation of tobacco leaves with ASPs addition 分

3 討論與結(jié)論

本研究從細(xì)辛中成功分離純化出了ASP1、ASP2、ASP3 3個組分。紫外掃描結(jié)果顯示，3個組分的紫外光譜曲線平滑，無明顯吸收峰，表明ASP1、ASP2和ASP3中核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)已基本去除完全，與紅外掃描結(jié)果一致。3個組分與碘反應(yīng)未變藍(lán)，說明3個組分均為非淀粉。紅外分析表明，3個組分均具有多糖特征峰，均為非淀粉多糖。掃描電鏡分析表明，ASP1、ASP2和ASP3結(jié)構(gòu)上均有較好的聚集性，做為保潤劑時可以更好地在煙絲表面形成網(wǎng)狀或膜狀結(jié)構(gòu)[24]。

細(xì)辛多糖各組分均有一定的保潤性和防潮效果，與楊君等[8]對裂片石莼多糖、黃芳芳等[10]對銅藻多糖和王小莉[13]對香加皮多糖等研究結(jié)果一致。細(xì)辛多糖在低濕條件下保潤性能均劣于甘油優(yōu)于純水，高濕條件下防潮效果均優(yōu)于甘油，且ASP1、ASP2和ASP3的保潤性和吸濕性無明顯差異。多糖因具有較多的羥基、羧基等親水性基團(tuán)，當(dāng)與水接觸時可以形成氫鍵從而吸附水分，同時能夠在煙絲表面形成網(wǎng)狀或膜狀結(jié)構(gòu)，從而減少煙絲內(nèi)部水分的散失。但影響多糖保潤性的因素很多，如多糖分子質(zhì)量、物理性質(zhì)、載體物理結(jié)構(gòu)等[25]。同時掃描電鏡圖表明，ASP1、ASP2和ASP3之間保潤性的差異，可能是因為其不同的構(gòu)象結(jié)構(gòu)導(dǎo)致。甘油保潤性優(yōu)于細(xì)辛多糖的原因可能是細(xì)辛多糖分子中的羥基呈游離態(tài)的較少，與水的結(jié)合性比甘油弱[26]。細(xì)辛多糖在防潮方面優(yōu)于甘油的原因，可能是因為在高濕條件下水分子與細(xì)辛多糖中的羧基結(jié)合形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在煙絲表面形成了一層薄膜，這層薄膜有效的阻礙了水分子繼續(xù)進(jìn)入煙絲；同時甘油中的親水基團(tuán)羥基或羧基更容易與水形成氫鍵而易于吸收環(huán)境中的水分[27]，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。

對于多糖的熱裂解產(chǎn)物及其在煙草中的應(yīng)用，劉珊等[11]對裙帶菜多糖、張翼飛等[14]對香加皮多糖及許春華等[28]對香料煙煙葉多糖的熱裂解產(chǎn)物等研究均表明，多糖的熱裂解產(chǎn)物中含有對煙草有益的致香物質(zhì)。細(xì)辛多糖的熱裂解產(chǎn)物，隨著裂解溫度的升高，ASP1、ASP2和ASP3中小分子量的易揮發(fā)性物質(zhì)先揮發(fā)，大分子物質(zhì)開始分解，同時小分子物質(zhì)由于受熱會發(fā)生聚合、縮合等復(fù)雜的反應(yīng)[29]。隨裂解溫度的升高，糠醛類物質(zhì)相對含量均有所下降；而酮類、呋喃類、吡啶類含量有所上升，可能是由于溫度升高，糠醛類物質(zhì)裂解、重排形成如酮類及一些雜環(huán)類小分子物質(zhì)，之所以有含氮化合物可能是蛋白質(zhì)殘留造成的。類似地，黃芳芳等[10]對銅藻多糖以及王全等[30]對枸杞多糖在無氧環(huán)境下的熱裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中也含有一定的含氮化合物。ASP1、ASP2和ASP3熱裂解產(chǎn)生的雜環(huán)類物質(zhì)，主要有吡啶、吡咯、吲哚等化合物，這類物質(zhì)可能是葡萄糖、半乳糖等殘基分解的產(chǎn)物，此類物質(zhì)一般具有焦香、焦甜香香味，卷煙中常添加的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物同屬此類物質(zhì)，可以提高卷煙香氣量[31]；酮類、醛類、酯類和酸類化合物一般具有甜香、果香香味，在卷煙中有醇和煙氣的作用[28]；酚類物質(zhì)可以產(chǎn)生酚香和藥草香氣，也是煙草和煙氣中的常見物質(zhì)[32]。卷煙中添加細(xì)辛多糖，通過感官評吸評價分析，結(jié)果表明，添加一定量的細(xì)辛多糖有助于豐富卷煙香氣提高香氣量，改善煙氣質(zhì)量提高香氣質(zhì)，在減少刺激性方面也有明顯提高。不同添加量感官質(zhì)量存在一定差異，0.4和0.6 g·kg-1的添加量較為適宜。類似地，劉珊等[11]和徐春華[33]等分別將裙帶菜多糖和檉柳核纖孔菌發(fā)酵多糖添加至卷煙進(jìn)行感官質(zhì)量評價，卷煙中添加一定量的多糖可以改善煙氣質(zhì)量。

本研究采用DEAE-52離子交換柱分離出ASP1、ASP2和ASP3。發(fā)現(xiàn)3個組分在低濕和高濕條件下均具有一定的保潤和防潮效果，其裂解產(chǎn)物中均含有對卷煙質(zhì)量有益的成分，并且感官質(zhì)量評價也表明了卷煙中添加一定量的細(xì)辛多糖有助于豐富卷煙香氣，改善煙氣質(zhì)量。綜上可知，細(xì)辛多糖對煙草具有一定的保潤性，且可裂解對煙草有益的致香物質(zhì)。雖然現(xiàn)有的研究已證明多糖的加入可以對卷煙品質(zhì)產(chǎn)生保潤增香的效果，但是其在卷煙中的應(yīng)用目前還比較少，對于細(xì)辛多糖添加至卷煙，燃燒過程中產(chǎn)生物質(zhì)及其產(chǎn)生的影響還需進(jìn)一步探究。