低溫冷凍條件下消毒劑殺滅效果測定技術(shù)研究

黃甜甜　周志南　徐新怡　楊啟立　夏琪琪　鹿燕

摘要： 目的? ?建立低溫冷凍條件下消毒劑殺滅效果的測定方法。方法選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩種代表性的菌種，進(jìn)行菌懸液配方和染菌載體優(yōu)化，以市場流通的冷鏈低溫消毒劑作為樣品，進(jìn)行低溫殺滅效果的測定。結(jié)果在-40℃、-20℃、4℃、20℃溫度下，常溫消毒劑低溫試驗結(jié)冰無法進(jìn)行殺滅試驗;未優(yōu)化的菌懸液低溫下平衡會結(jié)冰影響試驗結(jié)果，染菌載體菌落回收數(shù)明顯降低;在配方優(yōu)化后，低溫消毒劑在相應(yīng)低溫下用懸液定量法作用10min后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值均>5.00;載體噴霧定量法作用10min后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值均>3.00。結(jié)論該方法的研究建立適用于新冠疫情下低溫冷鏈低溫消毒劑的殺滅試驗，為其他實驗室的低溫模擬殺滅試驗提供一定的參考價值。

關(guān)鍵詞： 低溫消毒劑載體殺滅效果

中圖分類號：TB484.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ?文章編號：1672-3791（2022）07（a）-0000-00

Study on Determination Technology of Disinfectant Killing Effect Under Low Temperature Freezing Condition

HUANG Tiantian1，2? ZHOU Zhinan1，2? XU Xinyi1，2? YANG Qili1，2? XIA Qiqi1，2? LU Yan1，2

（1.Zhejiang Fangyuan Test Group Co.， Ltd;2.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biosafety detection for Market Regulation，Hangzhou，Zhejiang Province， 310018 China）

Abstract： Objective To establish a method for determining the killing effect of disinfectants under low temperature freezing conditions. Methods Two representative strains of Escherichia coli and Staphylococcus aureus were selected to optimize the bacterial suspension formula and bacterial carrier. The cold chain low-temperature disinfectant circulating in the market was used as a sample to determine the low-temperature killing effect. Results At the temperatures of - 40 ℃， - 20 ℃， 4 ℃ and 20 ℃， the normal temperature disinfectant was frozen and could not be killed; The balance of non optimized bacterial suspension will freeze at low temperature， which will affect the test results， and the colony recovery number of infected carrier will be significantly reduced; After optimizing the formula， the logarithm of killing Escherichia coli and Staphylococcus aureus by the suspension quantitative method at the corresponding low temperature for 10 minutes was > 5.00; The killing rate of Escherichia coli and Staphylococcus aureus by 10min was 3. Conclusion The study of this method is suitable for the killing test of COVID-19 low temperature cold chain low temperature disinfectant， and it can provide some reference value for other laboratories in low temperature simulated killing experiments.

Key Words： Low temperature; Disinfectant; Carrier; Killing effect

低溫下的消毒是新冠肺炎疫情后面臨的新問題，也需要安全有效的消毒劑和可靠的消毒方法，此前的消毒措施都是在常溫情況下進(jìn)行。而現(xiàn)在大家之所以關(guān)注低溫下的消毒，是因為低溫對消毒效果有明顯的影響，低溫有時候會導(dǎo)致消毒劑以及消毒能力顯著下降，甚至?xí)屵@些常見的消毒產(chǎn)品完全“失靈”[1]。

徐莉等人[2]在低溫環(huán)境下對某含氯消毒劑微生物消毒效果研究發(fā)現(xiàn)不同溫度條件下含氯消毒劑溶液的有效氯含量變化較大，其中當(dāng)溫度為-20℃時，含氯消毒劑溶液呈結(jié)冰狀態(tài)，對實驗結(jié)果影響較大。張英濤[3]等研究了低溫狀態(tài)下常用消毒劑消毒效果評價;姜秀梅等人[4]研究發(fā)現(xiàn)溫度對鄰苯二甲醛殺滅分枝桿菌的效果影響較大，低溫條件下其殺菌效果會降低。他們研究的低溫條件是4℃左右的低溫，未對-20℃和-40℃進(jìn)行研究。

現(xiàn)行有效的消毒方法依據(jù)是按消毒技術(shù)規(guī)范（2002版）進(jìn)行，都需要讓消毒劑置于20℃水于5min后進(jìn)行殺滅試驗。溫度對殺滅微生物效果影響的測定也只是設(shè)置以10℃、20℃、30℃等常規(guī)溫度對消毒劑殺滅各種微生物的影響。基于目前我國食品冷鏈狀況頻發(fā)，迫切地需要一些能在低溫下行之有效的消毒劑和消毒的方法[5]。

為解決全國疫情防控之急需，確保低溫消毒效果，2021年1月國家衛(wèi)生健康委辦公廳印發(fā)了《國家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于印發(fā)低溫消毒劑衛(wèi)生安全評價技術(shù)要求的通知》（國衛(wèi)辦監(jiān)督函﹝2020﹞1062號），其中附件《低溫消毒劑衛(wèi)生安全評價技術(shù)要求》對低溫條件下實驗室微生物殺滅試驗、現(xiàn)場試驗和低溫試驗進(jìn)行了相對簡單的闡述。實驗室微生物殺滅試驗也只用載體法進(jìn)行試驗，未對懸液定量法進(jìn)行說明，為此該研究以已研發(fā)的低溫冷凍消毒劑為代表，在低溫條件下進(jìn)行殺菌效果試驗，建立用于冷鏈?zhǔn)称钒b的消毒劑殺滅效果測定方法，為低溫消毒試驗提供參考。

1材料與方法

1.1材料

設(shè)備：高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、生物安全柜、高低溫試驗箱、加熱制冷浴槽等。

培養(yǎng)基及試劑：胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、聚山梨醇酯80（吐溫80）、0.85%無菌氯化鈉溶液、甘油。

中和劑：D/E中和肉湯（按消毒技術(shù)規(guī)范要求鑒定合格）[6]。

載體：不銹鋼金屬載片。

試驗菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 6538、大腸桿菌8099均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

消毒劑：A：次氯酸鈉（5%±0.5%）;

B：二氯異氰尿酸鈉（0.3%±0.03%）+氯化鈣（20%±5%）;

C：過氧化氫（3%±1%）;

D：苯扎氯銨（0.4%±0.04 %）+乙醇（35%±3.5%）;

E：二氯異氰尿酸鈉（0.5%±0.05%）+氯化鈣（30%±3%）;

F：過氧化的芐基烷基二甲基季銨鹽化合物（0.4%±0.1%）。

1.2方法

1.2.1低溫試驗

取5mL消毒劑放置于相應(yīng)低溫下過夜（>8h），觀察并記錄其性狀。該消毒劑保持液體狀態(tài)、無析出、無結(jié)晶，則判定為合格。

1.2.2細(xì)菌懸液的制備

取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌新鮮培養(yǎng)物加入5mL0.85%無菌氯化鈉溶液，洗下菌苔，并將洗脫液轉(zhuǎn)移至另一個無菌試管中，振蕩混勻。用0.85%無菌氯化鈉溶液稀釋至108CFU/mL的工作細(xì)菌懸液，并用加入適量的無菌甘油，使甘油的最終濃度為40%，2℃～8℃保存，24h可用。

1.2.3染菌載體制備

取加入甘油的試驗菌懸液將經(jīng)滅菌的載體片（1cm×1cm、經(jīng)脫脂處理）逐片進(jìn)行滴加染菌。菌液滴加量每片為10uL，并用接種棒涂勻整個載體表面。染菌后可將染菌載體置于37℃溫箱內(nèi)干燥20min或室溫下自然陰干。將染菌載體放入相應(yīng)低溫環(huán)境至少30min，確保指示微生物達(dá)到相應(yīng)低溫后，方可進(jìn)行載體噴霧試驗，且每個菌片的回收菌數(shù)應(yīng)為5×105CFU/片-5×106CFU/片。

1.2.4懸液定量殺滅試驗

試驗時，將加熱制冷浴槽分別調(diào)節(jié)溫度至-40℃、-20℃、4℃和20℃四個不同的溫度，將消毒劑4mL和含有機干擾物的試驗菌懸液1mL放入3個不同的低溫下平衡5min后，將消毒劑和含有有機干擾物的試驗菌懸液混合作用至規(guī)定時間，吸取混合液0.5mL加入至4.5mL經(jīng)滅菌的中和劑中，混勻，作用10min后計數(shù)，培養(yǎng)。同時做陽性對照，試驗重復(fù)3次。

1.2.5載體噴霧定量殺滅試驗

試驗時，將高低溫試驗箱分別調(diào)節(jié)溫度至-40℃、-20℃、4℃和20℃四個不同的溫度，將5片染菌載片各放置于無菌平皿內(nèi)，分別放置于高低溫試驗箱不同部位，當(dāng)消毒劑和染菌載片在相應(yīng)溫度下平衡30min后，用相應(yīng)濃度的消毒劑（反應(yīng)液）的電動噴霧器對上述染菌載片進(jìn)行均勻噴霧。噴霧量以不使菌片濕透、流液為度。待試驗菌和消毒劑作用至規(guī)定時間，取載片各移入5mL中和劑中，振蕩混勻，洗脫菌片上的細(xì)菌至中和劑中，作用10min后計數(shù)，培養(yǎng)。同時做陽性對照，試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1低溫試驗

消毒劑在低溫環(huán)境下的低溫試驗見表1。

2.2染菌載片菌數(shù)回收結(jié)果

與標(biāo)準(zhǔn)方法的染菌載片相比，該研究對染菌載片的制作進(jìn)行了配方優(yōu)化，加入甘油，以防止冰晶對細(xì)胞造成傷害。將按標(biāo)準(zhǔn)方法制作的染菌載片與優(yōu)化后的染菌載片進(jìn)行載體菌落回收，結(jié)果表明優(yōu)化后用于低溫條件下殺滅試驗的染菌載片的菌落回收數(shù)能達(dá)到5×105CFU/片～5×106CFU/片之間，回收數(shù)明顯高于未優(yōu)化的染菌載片。回收菌數(shù)的結(jié)果見表2。

2.3懸液定量殺滅試驗結(jié)果

結(jié)果表明，在-40℃、-20℃、4℃、20℃溫度下，消毒劑C、D、E和F對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值均>5.00;消毒劑B因在-40℃結(jié)冰因素影響無法進(jìn)行殺滅試驗，其他三個溫度下，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值均>5.00;消毒劑A是常溫下使用的消毒劑，故在-40℃和-20℃結(jié)冰因素影響無法進(jìn)行殺滅試驗，20℃時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值均>5.00。試驗結(jié)果見表3。

2.4載體噴霧定量殺滅試驗結(jié)果

結(jié)果表明，在-40℃、-20℃、4℃、20℃溫度下，消毒劑C、D、E和F對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值均>3.00;消毒劑B因在-40℃結(jié)冰因素影響無法進(jìn)行殺滅試驗，其他三個溫度下，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值均>3.00;消毒劑A是常溫下使用的消毒劑，故在-40℃和-20℃結(jié)冰因素影響無法進(jìn)行殺滅試驗，20℃時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值均>3.00。試驗結(jié)果見表3。

2.5溫度對消毒劑殺菌效果的影響。

從表3、表4可以看出，與作用溫度為20℃時的殺滅效果相比較，作用溫度為4℃時對消毒劑A作用10min的殺滅效果有中度影響;作用溫度為-20℃和-40℃時對消毒劑A作用10min的殺滅效果有重度影響;作用溫度-40℃時對消毒劑B作用10min的殺滅效果有重度影響;作用溫度-40℃、-20℃和4℃時對消毒劑C、D、E和F作用10min的殺滅效果無影響。

3 討論

細(xì)菌的組成成分和人類似，都是有水、糖、蛋白質(zhì)、核苷酸和脂質(zhì)（構(gòu)成細(xì)胞膜）組成[6];病毒則主要是由蛋白質(zhì)和核苷酸構(gòu)成，所以只要消毒劑能破壞掉蛋白質(zhì)或核苷酸的生理活性，就可以認(rèn)為它能夠同時消滅細(xì)菌與病毒。新出現(xiàn)的新冠病毒對外界的抵抗力不強，對紫外敏感，一般56℃ 30min的條件下就能殺死它，都能被75%乙醇、過氧化物類和含氯消毒劑等消毒劑有效地滅活[7]。消毒技術(shù)規(guī)范1.4.4.3規(guī)定了微生物對消毒因子的敏感性，代表有脂質(zhì)膜的親脂病毒是最容易被消毒劑所殺滅，而新冠病毒就是含有脂質(zhì)膜的親脂病毒的一種，對消毒因子的敏感性最高，是比細(xì)菌繁殖體更容易被消毒劑所殺滅，所以選擇抵抗力較新型冠狀病毒高的金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）和大腸桿菌（8099）作為指示微生物[5]。

目前低溫消毒劑已有幾款研制成功，通過了低溫試驗，低溫狀態(tài)下的殺菌效果試驗也有若干報道[8-9]，但都未對菌懸液和染菌載體進(jìn)行討論。殺滅試驗都需在試驗前對菌懸液和染菌載體進(jìn)行相應(yīng)溫度的平衡，如不進(jìn)行優(yōu)化則會在低溫環(huán)境下結(jié)冰無法進(jìn)行試驗和影響載體的菌數(shù)回收。甘油作為防凍劑能有效防止液體冰晶對細(xì)胞造成傷害，能有效降低冰點，但甘油濃度過低在低溫殺滅試驗時易結(jié)冰，使菌死亡，濃度過高也會使菌脫水導(dǎo)致死亡，故該試驗最終確立的甘油濃度為40%。

常規(guī)消毒方式對環(huán)境溫度條件都有明確的要求，均在常溫條件下進(jìn)行。由于這些消毒劑均是以水作為溶劑，在低溫冷凍條件下，液體消毒劑冷凝成為固態(tài)，難以發(fā)揮消毒作用，故在低溫環(huán)境下進(jìn)行的消毒還需考慮如何降低消毒劑的冰點及保證在低溫條件下的消毒效果等[9]。

4 結(jié)論

該研究選定的消毒劑經(jīng)低溫試驗后可用于消毒劑的殺滅試驗，經(jīng)驗證，常規(guī)的消毒劑如消毒劑A溫度對消毒劑的殺滅效果影響較大，消毒劑C和F因本身冰點低，溫度對消毒劑的殺滅效果無影響，消毒劑B、D和E在加了相應(yīng)的防凍劑后能用于低溫環(huán)境下的消毒。

該研究結(jié)論表明，低溫消毒劑經(jīng)低溫試驗驗證后，試驗溫度為在-40℃、-20℃、4℃、20℃溫度下，常溫消毒劑低溫試驗結(jié)冰無法進(jìn)行殺滅試驗;未優(yōu)化的菌懸液低溫下平衡會結(jié)冰影響試驗結(jié)果，染菌載體菌落回收數(shù)明顯降低;在配方優(yōu)化后，低溫消毒劑在相應(yīng)低溫下用懸液定量法作用10min后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值均>5.00;載體噴霧定量法作用10min后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值均>3.00。該方法的研究建立適用于新冠疫情下低溫冷鏈低溫消毒劑的殺滅試驗，能為其他實驗室的低溫模擬殺滅試驗提供一定的參考價值。

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作者簡介：黃甜甜（1994—），女，本科，助理工程師，研究方向為微生物檢測。

DOI：10.16661/j.cnki.1672-3791.2201-5042-1177