微量硫?qū)﹁F錳合金的生物相容性及降解的影響

馮靖雯，徐文利，陳軍修，譚麗麗，楊澤

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院正畸科，遼寧省口腔疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110002；2.中國(guó)科學(xué)院金屬研究所師昌緒先進(jìn)材料創(chuàng)新中心，沈陽(yáng) 110016；3.常州大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 常州 213164）

研究［1-2］顯示，鐵基合金具有優(yōu)異的機(jī)械性能和良好的生物相容性，在具有可降解性的心血管支架中具有良好的應(yīng)用前景。有研究［3］表明心血管可降解鐵基支架材料中鐵錳（Fe-Mn）合金的力學(xué)性能和順磁性相當(dāng)于316L不銹鋼。另外，研究顯示Fe-Mn合金浸泡7 d后分解速度高于純鐵且低于鎂合金［4］；Fe-Mn合金浸泡15 d后的降解速度與純鐵相同，為0.23～0.24 mm/年［5］。為了進(jìn)一步加快Fe-Mn合金的降解速度，MORAVEJ等［6-7］研究顯示，將純鐵制成超微晶粒薄膜進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，純鐵超微晶粒的降解速度為0.40 mm/年，顯著高于純鐵的降解速度（0.14 mm/年）。2010年SCHINHAMMER等［8］提出了可以改變鐵基降解速度的設(shè)想：（1）將活性金屬加入鐵內(nèi)，使鐵基合金的降解速度加快；（2）鐵中添加惰性金屬元素，在合金內(nèi)部形成彌散分布的微小金屬化合物，此化合物與基體形成電偶腐蝕。SCHINHAMMER等根據(jù)設(shè)想（2）制做了Fe-Mn-Pd系列合金，合金中分布著富含Pd的FePd和MnPd化合物，研究結(jié)果顯示，與碳鋼比較，合金極化電阻降低，降解速度加快。也有研究［9］表明，加入非金屬（碳）顯著加快了Fe-Mn合金（Fe-30Mn-1C）的降解速度。目前，關(guān)于硫（S）對(duì)Fe-Mn合金降解的影響研究鮮有報(bào)道。本研究探討微量S對(duì)Fe-Mn合金的生物形容性和降解的影響。

1 材料與方法

1.1 合金制備

純鐵、純錳和S購(gòu)于沈陽(yáng)博宇有色金屬爐料有限公司。合金冶煉在中國(guó)科學(xué)院金屬研究所完成。合金制作過(guò)程：使用1 kg真空感應(yīng)爐，分別制作成分為Fe-30Mn-0.05S（wt.%）和Fe-30Mn的鐵基合金。然后利用中國(guó)科學(xué)院金屬研究所鍛造機(jī)在1 050 ℃下持續(xù)鍛造1 h，鍛造后放在空氣中進(jìn)行冷卻，最終獲得直徑25 mm的圓棒。將圓棒放在1 100 ℃的電阻爐中加熱30 min后迅速取出放到室溫水中冷卻，然后吹干備用。利用X射線衍射儀（X-ray powder diffractometer，XRD；D/MAX-RB，日本理學(xué)公司）對(duì)合金的成分進(jìn)行觀察和分析。利用線切割將合金切成10 mm×10 mm×2 mm的圓片進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2 電化學(xué)測(cè)試

電化學(xué)測(cè)試在V3（型號(hào)為Princeton Applied Research Versa STAT3）電化學(xué)工作站進(jìn)行。采用標(biāo)準(zhǔn)三電極體系，樣品為工作電極，鉑片作為輔助電極，飽和甘汞作為參比電極。將樣品用環(huán)氧樹(shù)脂固定，樣品的一端面連接銅線，另一端面露在外面，其面積為1 cm2，并將露在外面的端面精細(xì)拋光。在開(kāi)路電位-時(shí)間測(cè)試中，測(cè)試樣品直到開(kāi)路電位穩(wěn)定為止。在測(cè)試中，先后測(cè)量開(kāi)路電位，然后在開(kāi)路電位下進(jìn)行Electrochemical Impedance Spectroscopy（EIS）測(cè)試，電化學(xué)測(cè)試中使用的溶液為生理鹽水溶液，pH7.4，溫度37 ℃，樣品面積和溶液體積為1 ∶350（cm2/ mL）。

1.3 體外浸泡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品的降解速度

樣品打磨后經(jīng)過(guò)清洗、吹干后稱(chēng)重。然后將樣品浸入生理鹽水中，37 ℃恒溫保存。為了使酸堿度穩(wěn)定，前10 d換液頻率為1次/2 d，然后換液頻率為1次/5 d。14 d后取出樣品，經(jīng)無(wú)水乙醇清洗、吹干后利用XRD觀察和分析。樣品的降解速度計(jì)算公式［10］：

其中，CR為降解速度（mm/年），W為樣品質(zhì)量減重（g），A為樣品在溶液中面積（cm2），t為樣品在溶液中的時(shí)間（h），ρ為樣品密度（g/cm3）。利用德國(guó)Dataphysics 接觸角測(cè)量?jī)x TBU 95 測(cè)量樣品表面能，計(jì)算采用OWRK幾何平均法。

1.4 溶血率檢測(cè)

溶血率檢測(cè)按ISO10993-12：2007（E）及YY/T0127.1-93標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。取新鮮兔耳靜脈抗凝血（1 mL），與0.9% PBS溶液按照4 ∶5比例混合。將Fe-30Mn合金和 Fe-30Mn-0.05S合金樣品按比例（表面積∶溶液體積為 1.25 ∶1 cm2/mL）置于PBS溶液中，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)30 min，然后加入稀釋兔血（兔血∶溶液為1 ∶50）繼續(xù)恒溫箱中培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出樣品，3 000 r/min離心5 min，取上清液用DR6000 分光光度計(jì)（美國(guó)哈希HACH公司）在540 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)其吸光度。每種樣品測(cè)試3次，計(jì)算其平均值。溶血率計(jì)算公式［11］：

其中，Dt為合金樣品的吸光度值，Dnc為陰性對(duì)照組（PBS液）吸光度值，Dpc為陽(yáng)性對(duì)照組（水）吸光度值。陽(yáng)性對(duì)照組吸光度值應(yīng)為0.8±0.3，陰性對(duì)照組吸光度值應(yīng)≤0.03。參考標(biāo)準(zhǔn)：參考值>5%，樣品有溶血作用；參考值≤5%，樣品可以植入［12］。

1.5 血小板黏附能力檢測(cè)

Fe-30Mn合金和Fe-30Mn-0.05S合金樣品清洗后干燥，然后放在孔板上進(jìn)行紫外線消毒。采集健康志愿者靜脈血，使用20 g/L草酸鉀作抗凝劑，血液和抗凝劑比例為20 ∶1。，將抗凝血1 500 r/min離心15 min后取上清液，得到新鮮富血小板血漿。將2種樣品浸泡于富血小板血漿中，37 ℃恒溫箱中分別培養(yǎng)0.5 h、3 h，然后吸去富血小板血漿并立即加入PBS溶液靜置10 min，再吸走PBS，漂洗2～3次后加入2.5 %戊二醛溶液，放入4 ℃冰箱固定12 h。Fe-30Mn合金和Fe-30Mn-0.05S合金樣品乙醇梯度脫水和脫醇，經(jīng)干燥和噴金處理后，Apreo 2掃描電子顯微鏡（中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）觀察合金樣品表面血小板的黏附數(shù)量和形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 2種合金成分分析

結(jié)果顯示，合金經(jīng)固溶處理后，F(xiàn)e-30Mn合金顯示為單一的奧氏體相，而Fe-30Mn-0.05S合金中除了奧氏體相外，還存在ε、α馬氏體。Mn是奧氏體穩(wěn)定元素，擴(kuò)大奧氏體區(qū)域，α區(qū)縮小。在Fe-30Mn合金中只存在γ相，而加入少量S后，合金中檢測(cè)到少量的α相和ε相，S擴(kuò)大了鐵素體區(qū)域，表明它是鐵素體穩(wěn)定化元素，且可以促進(jìn)ε碳化物的形成。碳化物及α相的形成將對(duì)合金的耐蝕性能產(chǎn)生重要影響。見(jiàn)圖1 。

圖1 2種合金XRD圖譜

2.2 2種合金降解性能分析

Bode圖和相位角圖與合金的降解性能密切相關(guān)，Bode圖反映阻抗與頻率的關(guān)系，在低頻下，阻抗值越大，合金的耐蝕性能越好［13］。如圖2 所示，合金在0.9%NaCl溶液中的阻抗譜曲線，在0.01 Hz下，F(xiàn)e-30Mn合金的阻抗值為210 Ω·cm2，F(xiàn)e-30Mn-0.05S合金的阻抗值為144 Ω·cm2，表明Fe-30Mn-0.05S合金的降解速度快于Fe-30Mn合金。相位角圖反映相位角與頻率的關(guān)系，通過(guò)相位角峰值個(gè)數(shù)可判斷合金的時(shí)間常數(shù)，進(jìn)而判斷合金的腐蝕機(jī)制是否相同。結(jié)果顯示，2種合金均具有1個(gè)峰值，相應(yīng)有1個(gè)時(shí)間常數(shù)。2種合金的腐蝕機(jī)制相似［14］。從阻抗譜的相位角曲線上可看出，合金被腐蝕后樣品表面的粗糙度會(huì)增加，耐蝕性能越差，表面粗糙度越大，因而也可表明Fe-30Mn合金的降解速度慢于Fe-30Mn-0.05S合金。體外浸泡實(shí)驗(yàn)是研究合金耐蝕性能最有效、最直觀的方法。2種合金在0.9%NaCl溶液中的單位面積失重和降解速度見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，F(xiàn)e-30Mn-0.05S合金的失重隨著浸泡時(shí)間增加呈現(xiàn)線性增加，且在不同時(shí)間點(diǎn)其損失的質(zhì)量均顯著大于Fe-30Mn合金。Fe-30Mn合金和Fe-30Mn-0.05S合金在0.9%NaCl溶液中的降解速度分別約為0.10 mm/年和0.14 mm/年，可見(jiàn)加入微量S使Fe-30Mn合金的降解速率提升了40%。

圖2 2種合金樣品在0.9%NaCl溶液中的阻抗譜曲線

圖3 2種合金樣品在0.9%NaCl溶液中的失重和腐蝕速度

2.3 2種合金表面能分析

結(jié)果顯示，F(xiàn)e-30Mn的極性分量（γsd）、色散分量（γsp）、γsp/γsd分別為43.85 dyn/cm、29.33 dyn/cm、66.89%；Fe-30Mn-0.05S的γsd、γsp、γsp/γsd分別為43.47 dyn/cm、32.90 dyn/cm、75.7%。2種合金γsp/γsd均較高，說(shuō)明2種合金均擁有良好抗血小板黏附性能。見(jiàn)圖4。

圖4 2種合金XRD圖譜

2.4 2種合金溶血率及血小板黏附性能

結(jié)果顯示，F(xiàn)e-30Mn合金、Fe-30Mn-0.05S合金的溶血率分別為2.04%、2.11%，F(xiàn)e-30Mn-0.05S合金略高于Fe-30Mn合金。2種合金的溶血率均<5%，表明都符合植入標(biāo)準(zhǔn)。

血小板黏附性能檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)e-30Mn合金、Fe-30Mn-0.05S合金與血小板接觸 30 min 后表面上附著少量血小板，血小板處于靜息狀態(tài)，未觀察到偽足；接觸180 min后，樣品表面均未見(jiàn)有血小板黏附，見(jiàn)圖5。

圖5 2種合金樣品血小板黏附情況 ×500

3 討論

3.1 S對(duì)Fe-Mn合金降解性能的影響

研究表明，在鐵中加入錳可以加快腐蝕速度。HERMAWAN等［15］研究Fe-Mn合金發(fā)現(xiàn)，合金的降解形貌相近，其降解速率為520 mm/年，約為純鐵的2倍。研究［16］顯示，S作為鐵合金的雜質(zhì)，會(huì)加速鐵合金的腐蝕。主要原理包括：（1）S與鐵和錳化合形成FeS和MnS化合物，由于這些化合物電極電位比鐵基體高，因而其與鐵容易形成原電池，鐵基體作為陽(yáng)極，化合物作為陰極加速鐵合金的腐蝕速度；（2）S加入使原本具有單一奧氏體相的合金中出現(xiàn)了鐵素體相，兩相之間存在電位差，在腐蝕性介質(zhì)中易于形成原電池，從而加快Fe-Mn合金的腐蝕速度。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)e-30Mn-0.05S合金降解速度比Fe-30Mn合金更快，與以往研究結(jié)果一致。

3.2 S對(duì)Fe-Mn合金血液相容性的影響

結(jié)果顯示，F(xiàn)e-30Mn合金、Fe-30Mn-0.05S合金的溶血率分別為2.04%、2.11%，F(xiàn)e-30Mn-0.05S合金略高于Fe-30Mn合金。2種合金的溶血率均<5%，表明2種合金都符合植入標(biāo)準(zhǔn)，滿足醫(yī)用植入材料對(duì)溶血性能的要求。同時(shí)，2種合金溶血率與降解速度一致，這可能是因?yàn)檩^高的降解速度使周?chē)芤涵h(huán)境pH 值升高，較高的降解速度導(dǎo)致了相對(duì)較高的溶血率。

2種合金血小板黏附檢測(cè)結(jié)果顯示，與血小板接觸30 min、180 min后均未出現(xiàn)血小板黏附，說(shuō)明2種合金都具有良好的抗血小板黏附能力。

綜上所述，F(xiàn)e-30Mn-0.05S合金顯示出良好的降解性能和血液相容性，在可降解心血管支架方面具有良好的應(yīng)用前景。本研究?jī)H探討了Fe-30Mn-0.05S合金的降解性能和血液相容性，合金的生物學(xué)性能（細(xì)胞毒性、成骨性能等）研究還需要深入開(kāi)展，合金的體內(nèi)降解及代謝機(jī)制還需要進(jìn)一步明確。