李向龍 張中保 張春 鄭登俞 王作平 吳忠義
摘要:為探討花粉管通道法加聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)、加細(xì)胞穿膜肽(CPPs)介導(dǎo)與直接導(dǎo)入外源基因3種方式間的轉(zhuǎn)化率差異,對2種玉米自交系材料京2416和京92進(jìn)行花粉管通道法轉(zhuǎn)化并統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明,3種方式均能獲得草甘膦抗性植株,在京2416受體中PEG介導(dǎo)較直接導(dǎo)入高0.45百分點(diǎn),CPPs介導(dǎo)的較直接導(dǎo)入的高0.66百分點(diǎn),三者間轉(zhuǎn)化率差異達(dá)顯著或極顯著水平;對T0代草甘膦抗性植株P(guān)CR進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)因外源基因丟失或沉默,草甘膦抗性植株未必都含有目的基因,因此田間篩選應(yīng)與PCR檢測相結(jié)合;北京市農(nóng)林科學(xué)院房山轉(zhuǎn)基因基地轉(zhuǎn)化驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種導(dǎo)入方式其草甘膦抗性率和轉(zhuǎn)化率高低順序一致,均為CPPs介導(dǎo)>PEG介導(dǎo)>對照,與海南省三亞市崖城基地轉(zhuǎn)化相同,且CPPs介導(dǎo)和PEG介導(dǎo)二者間差異極顯著,京2416中二者相差0.26百分點(diǎn),京92中相差0.36百分點(diǎn)。因此,在花粉管通道法轉(zhuǎn)化玉米過程中加入介導(dǎo)物質(zhì)有助于提高轉(zhuǎn)化率,且加CPPs比加PEG更具有優(yōu)勢。
關(guān)鍵詞:玉米;花粉管通道法;介導(dǎo)物質(zhì);轉(zhuǎn)化率;比較分析
中圖分類號:S513.032 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A
文章編號:1002-1302(2022)12-0091-04
收稿日期:2021-08-19
基金項(xiàng)目:北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)(編號:KJCX20200603、KJCX20200205、KJCX20200407)。
作者簡介:李向龍(1981—),男,內(nèi)蒙古磴口人,碩士,助理研究員,主要從事玉米遺傳育種研究。E-mail:long8888380@126.com。
通信作者:吳忠義,研究員,博士生導(dǎo)師,主要從事玉米分子育種研究。E-mail:zwu22@126.com。
隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟,眾多轉(zhuǎn)化方法在玉米遺傳轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要的作用。自周光宇報(bào)道花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)以來[1],該技術(shù)在國內(nèi)被廣泛應(yīng)用,目前已在水稻、小麥等多種作物中應(yīng)用,并獲得轉(zhuǎn)基因陽性株系[2-5]。研究者在玉米中利用花粉管通道法進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí),多以在授粉后的玉米花絲上直接加外源基因?yàn)橹鳎D(zhuǎn)化效率不理想。隨著研究的深入,該方法逐漸被優(yōu)化,如在轉(zhuǎn)化過程中添加聚乙二醇(polyethylene-glycol,PEG)或細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)作為介導(dǎo)物質(zhì),來提高其轉(zhuǎn)化率。由于PEG作為一種細(xì)胞融合劑,可引起細(xì)胞膜表面電荷的紊亂并干擾細(xì)胞間的識別,從而介導(dǎo)細(xì)胞間融合或外源DNA分子進(jìn)入原生質(zhì)體[6],而CPPs作為小分子多肽,可攜帶疏水性大分子(如DNA)進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)并將其帶入細(xì)胞[7]。目前劉銅等用這2種方式進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化,均獲得了陽性植株[8-9],但二者與直接加外源基因進(jìn)行導(dǎo)入的轉(zhuǎn)化效率是否存在差異尚未見報(bào)道。本研究以直接滴入外源DNA溶液為對照,通過添加CPPs和PEG等2種方式與對照組進(jìn)行轉(zhuǎn)化率差異比較,確定花粉管通道法的最佳導(dǎo)入方法,以期為該方法在玉米遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用中獲得較高轉(zhuǎn)化率提供技術(shù)參考和指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1 材料和試劑
1.1.1 試驗(yàn)材料 用于轉(zhuǎn)化的玉米自交系為京2416和京92,由筆者所在課題組的實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.2 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn) 018年初在海南省三亞市崖城基地(簡稱“崖城基地”)進(jìn)行花粉管通道法轉(zhuǎn)化,2018年6月在北京市農(nóng)林科學(xué)院房山轉(zhuǎn)基因基地(簡稱“房山基地”)播種T0代,噴施草甘膦除草劑,并對抗性植株自交授粉;為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果,2018年7月在北京基地再次進(jìn)行轉(zhuǎn)化,11月將轉(zhuǎn)化種子在崖城基地進(jìn)行篩選和檢測。
1.1.3 外源DNA制備 60 ng/μL含抗草甘膦Epsps基因的外源DNA溶液由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備并保存。
1.1.4 試驗(yàn)試劑 1 mg/mL CPPs由筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存;PEG粉劑由生工生物工程(上海)股份有限公司提供;1 mol/L CaCl2溶液由上海金穗生物科技有限公司提供;除草劑選用美國孟山都公司研制的41%草甘膦異丙胺鹽水劑(農(nóng)達(dá),Rroundup)。
1.2 轉(zhuǎn)化流程及導(dǎo)入方式
花粉管通道法的轉(zhuǎn)化流程為玉米雌穗未吐絲前先套袋,待花絲長至8~10 cm時(shí)進(jìn)行自交授粉并套袋,依據(jù)前期對兩受體材料轉(zhuǎn)化時(shí)間經(jīng)驗(yàn),授粉18 h后將雌穗頂部苞葉和花絲同時(shí)剪去,為防止溶液外流,將切口處苞葉內(nèi)花絲剪成凹口再進(jìn)行滴入。
1.2.1 直接導(dǎo)入 以直接滴入外源DNA溶液為對照,轉(zhuǎn)化時(shí)將溶液稀釋至30 ng/μL,滴入360 μL,每個(gè)受體轉(zhuǎn)化15穗,重復(fù)3次。
1.2.2 PEG介導(dǎo) 在50 mL離心管中先加入 4 g PEG、14.6 mL滅菌超純水和0.4 mL的1 mol/L CaCl2,再和外源DNA溶液等體積混勻后進(jìn)行導(dǎo)入。轉(zhuǎn)化溶液終濃度、滴入量、轉(zhuǎn)化穗數(shù)及重復(fù)次數(shù)同“1.2.1”節(jié)。
1.2.3 CPPs介導(dǎo) 將CPPs和外源DNA溶液等體積混合后進(jìn)行導(dǎo)入。轉(zhuǎn)化溶液終濃度、滴入量、轉(zhuǎn)化穗數(shù)及重復(fù)次數(shù)同“1.2.1”節(jié)。
1.3 轉(zhuǎn)化后代草甘膦篩選
轉(zhuǎn)化獲得的T0、T1代種子,人工開溝條播,行長4 m,行距30 cm,3次重復(fù)。待幼苗生長至3葉1心期噴施草甘膦除草劑,濃度為200 mg/L。噴藥前統(tǒng)計(jì)出苗數(shù),噴藥后觀察其藥害反應(yīng)及抗性,10 d后調(diào)查抗性株數(shù),統(tǒng)計(jì)草甘膦抗性率。
抗性率=抗性植株數(shù)/出苗植株數(shù)×100%。
1.4 目的基因的PCR檢測
采用CTAB法[10]提取3種方式獲得的T0、T1代草甘膦抗性植株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用于轉(zhuǎn)基因抗性植株檢測的PCR上游引物為5′-ACAGCACCTTCATCGGCGACGCCTC-3′,下游引物為5′-GCATCTTTCCGTATGATAGGGCATC-3′,目標(biāo)片段長度為292 bp。PCR擴(kuò)增體系為20 μL,擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ ?min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min,獲得PCR產(chǎn)物。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測Epsps基因,根據(jù)目的基因陽性條帶的植株來統(tǒng)計(jì)3種導(dǎo)入方式的轉(zhuǎn)化率。
轉(zhuǎn)化率=陽性植株數(shù)/出苗植株數(shù)×100%。
1.5 數(shù)據(jù)處理
用Microsoft Excel 007軟件和DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同導(dǎo)入方式對幼苗草甘膦抗性表型
由圖1可知,植株對草甘膦藥害反應(yīng)表現(xiàn)一致,抗性植株葉色及長勢正常,不抗植株葉片先變紫,再變黃,最后整株干枯死亡。對比田間篩選結(jié)果,發(fā)現(xiàn)3種方式草甘膦抗性植株和無抗性植株差異特別明顯,且PEG介導(dǎo)和CPPs介導(dǎo)等2種導(dǎo)入方式獲得的抗性植株表現(xiàn)與對照沒有差異;2個(gè)受體轉(zhuǎn)化后代對草甘膦藥害反應(yīng)一致,抗性植株未出現(xiàn)藥害,葉色鮮綠,植株生長未受影響。
2.2 不同導(dǎo)入方式T0代草甘膦抗性差異比較
由表1可知,T0代2個(gè)受體材料間出苗數(shù)相差較大,主要是由二者間雌穗結(jié)實(shí)粒數(shù)不同造成的。3種方式在房山基地篩選,都獲得了草甘膦抗性植株,它們在2個(gè)受體內(nèi)的抗性率變化趨勢表現(xiàn)一致,均以加CPPs介導(dǎo)最高,分別為1.12%、1.27%;PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法次之,分別為0.91%、0.95%;對照最低,均不高于0.46%。經(jīng)過方差分析可知,CPPs介導(dǎo)和PEG介導(dǎo)之間的抗性率在2個(gè)受體中分別相差0.21、0.32百分點(diǎn),達(dá)顯著和極顯著水平;2種方式與對照間抗性率差異達(dá)極顯著水平,在京2416受體中與對照相比分別高0.66、0.45百分點(diǎn),在京92受體中分別高0.82、0.50百分點(diǎn)??梢姡?種導(dǎo)入方式之間存在差異,且加入介導(dǎo)物質(zhì)后有助于提升花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率。
2.3 T0代草甘膦抗性植株Epsps基因的PCR檢測
以受體基因組DNA和水為陰性對照,質(zhì)粒為陽性對照,對房山基地篩選得到的T0代草甘膦抗性植株進(jìn)行Epsps基因的PCR檢測。由圖2可知,陰性對照和水均未出現(xiàn)特異性條帶,21株抗草甘膦植株得到的陽性片段中有11株約為292 bp的條帶,與目的基因條帶大小一致,初步證明外源目的基因已成功整合到京92轉(zhuǎn)基因植株基因組中。
2.4 不同導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化率差異比較
通過對3種導(dǎo)入方式獲得的T0代草甘膦抗性植株進(jìn)行PCR檢測,平均轉(zhuǎn)化率結(jié)果見表2。結(jié)合表1和表2可知,3種方式的草甘膦抗性株獲得Epsps目的基因陽性條帶數(shù)量略有減少,可能與基因的丟失或沉默有關(guān),說明田間篩選應(yīng)和室內(nèi)篩選相結(jié)合,以增加結(jié)果的可靠性。通過方差分析可知,三者在受體間的轉(zhuǎn)化率高低順序一致,依次為CPPs介導(dǎo)>PEG介導(dǎo)>對照,CPPs、PEG分別比對照高0.63、0.37百分點(diǎn);同時(shí)對PEG和CPPs等2種導(dǎo)入方式進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)京2416用CPPs介導(dǎo)的平均轉(zhuǎn)化率為0.89%,較PEG介導(dǎo)顯著高0.26百分點(diǎn),京92用CPPs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率為1.09%,較PEG介導(dǎo)極顯著高0.36百分點(diǎn),進(jìn)一步說明花粉管通道法轉(zhuǎn)化中用CPPs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率高于PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率。
2.5 不同導(dǎo)入方式對受體轉(zhuǎn)化率的驗(yàn)證
為進(jìn)一步驗(yàn)證上述試驗(yàn)結(jié)果,2018年7月在北京基地繼續(xù)以京2416和京92為受體,用3種導(dǎo)入方式對2種材料進(jìn)行花粉管通道轉(zhuǎn)化,獲得的T0代種子在崖城基地播種后進(jìn)行草甘膦篩選,取抗性植株的葉片在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行PCR檢測(表3)。
由方差分析結(jié)果(表3)可知,3種導(dǎo)入方式在崖城基地獲得的T0代植株草甘膦平均抗性率在受體間表現(xiàn)與在房山基地一致,由高到低依次為CPPs介導(dǎo)>PEG介導(dǎo)>對照,且三者間差異達(dá)極顯著水平;平均轉(zhuǎn)化率變化與之相似,CPPs介導(dǎo)和PEG介導(dǎo)等2種方法顯著高于對照,京2416受體中分別高0.61、0.27百分點(diǎn),京92受體中分別高0.74、0.37百分點(diǎn),這進(jìn)一步驗(yàn)證了花粉管通道法在進(jìn)行玉米遺傳轉(zhuǎn)化時(shí),加入介導(dǎo)物質(zhì)可顯著提高其轉(zhuǎn)化效率,且CPPs介導(dǎo)轉(zhuǎn)化率高于PEG介導(dǎo)。
3 結(jié)論與討論
本研究在采用花粉管通道法轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上,通過外加CPPs、PEG輔助和DNA溶液直接導(dǎo)入3種方式均獲得了草甘膦抗性玉米植株,且三者之間存在顯著或極顯著差異,說明花粉管通道法在轉(zhuǎn)化時(shí)加入CPPs或PEG介導(dǎo)物質(zhì)有助于提高其轉(zhuǎn)化效率。3種導(dǎo)入方式均有抗草甘膦除草劑的植株,但是PCR檢測后含有目的基因的陽性植株有所減少,說明草甘膦除草劑篩選出的抗性植株還要結(jié)合PCR檢測,這樣才能確保轉(zhuǎn)化篩選結(jié)果的可靠性。
PEG介導(dǎo)、CPPs介導(dǎo)和直接滴入3種導(dǎo)入方法最終都獲得了含Epsps基因的抗性植株,但三者之間有差異,加介導(dǎo)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率要高于對照,CPPs介導(dǎo)和PEG介導(dǎo)相比,前者可以獲得更高的轉(zhuǎn)化率,京2416中二者相差0.26百分點(diǎn),京92中則相差0.36百分點(diǎn),說明花粉管通道法在進(jìn)行玉米轉(zhuǎn)化時(shí)要加入介導(dǎo)物質(zhì),且以CPPs介導(dǎo)最佳。
在崖城基地對房山基地轉(zhuǎn)化的T0代材料進(jìn)行篩選驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)3種導(dǎo)入方式的除草劑抗性及遺傳轉(zhuǎn)化率高低順序未發(fā)生變化,三者間差異達(dá)極顯著水平。本試驗(yàn)為2地2季的統(tǒng)計(jì)結(jié)果,3種方式在受體間的差異還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
花粉管通道法利用植物授粉后所形成的花粉管通道將外源DNA攜帶入胚囊,其優(yōu)點(diǎn)是不再依賴組培再生植株,操作簡單,常規(guī)育種工作者易于掌握[11]。在玉米轉(zhuǎn)化過程中,其轉(zhuǎn)化率除受外界環(huán)境因素影響外,更主要的影響因素是轉(zhuǎn)化方法本身,筆者所在課題組在多年的實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)加入介導(dǎo)物質(zhì)可提高玉米的遺傳轉(zhuǎn)化效率。
本研究采用的3種導(dǎo)入方法都能獲得草甘膦抗性植株,但PCR檢測時(shí)仍存在無陽性條帶的現(xiàn)象,可能是外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞后,在遺傳過程中會(huì)被細(xì)胞中的核酸酶逐漸降解,進(jìn)而使得基因沉默或丟失,最終導(dǎo)致目的基因不能都在草甘膦抗性植株中表達(dá),說明在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性植株檢測時(shí),除草劑篩選要和PCR檢測相互結(jié)合起來,避免假陽性的出現(xiàn)。
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