基于響應(yīng)面法優(yōu)化紅參酸乳工藝研究

尹智彥，韓梅，林紅梅，李佳思，楊利民

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118）

紅參為人參（Panax Ginseng C.A.Meyer）栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖[1]，除了含有常規(guī)皂苷，還產(chǎn)生了 Rg3、20（R）-Rg2、Rg5[2]、Rg6等特有皂苷[3]。在藥用價(jià)值方面，紅參可以作為哮喘、阿爾茲海默癥和預(yù)防結(jié)腸炎相關(guān)癌癥的潛在治療藥物[4-6]。而在食品領(lǐng)域，紅參產(chǎn)品也日趨豐富，如紅參多糖飲料[7]、拐棗子紅參壓片[8]和紅參石榴膠原蛋白肽復(fù)合飲品[9]等。

酸奶是以牛奶為原料，經(jīng)巴氏殺菌后發(fā)酵制成的一款乳制品，具有改善睡眠[10]、緩解原發(fā)性高血壓[11]、維護(hù)腸道菌群生態(tài)平衡[12]、提升免疫力[13]和延緩衰老[14]等功效。此外，由于益生菌對(duì)原料乳中乳糖和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化及分解，不僅提高了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率而且增加了VB2、VB6等次生代謝產(chǎn)物[15-16]。

為提高酸奶的保健價(jià)值，促進(jìn)中草藥在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，本研究將紅參與牛乳結(jié)合研制紅參酸乳，采用Plackett-Burman試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定紅參酸乳的最佳工藝，以期為促進(jìn)紅參在食品領(lǐng)域的應(yīng)用與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅參（四年生）、白砂糖、牛奶：市售；菌粉（10菌型）：昆山佰生優(yōu)生物科技有限公司。

無水乙醇、冰乙酸、濃硫酸、酒石酸鉀鈉、氯化鈉硼酸、鹽酸、乙酸鋅、硫酸鉀、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉、硫酸銅（均為分析純）：北京化工廠；MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；改良MRS培養(yǎng)基配套試劑：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)凱氏定氮儀（K9860）：山東海能科學(xué)儀器有限公司；電子天平（AUY220）、可見分光光度計(jì)（UV-1700）：日本島津儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（ZX-9070MBE）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋（DK-S28）：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（GI54DWS）：廈門致微儀器有限公司；高效液相色譜儀（1260 infinityⅡ）：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

純牛奶→60℃預(yù)熱→添加白砂糖和紅參粉→均質(zhì)（均質(zhì)袋）→60℃滅菌30 min→冷卻→添加菌粉→恒溫發(fā)酵→4℃，后熟12 h→成品

1.3.2 單因素試驗(yàn)

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定純牛奶300 mL，選取不同紅參粉添加量（1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 g）、菌粉添加量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g）、白砂糖添加量（6、12、18、24、30、36 g）、發(fā)酵時(shí)間（4、6、8、10、12、14 h）及發(fā)酵溫度（35、37、39、41、43、45 ℃）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，采用主成分分析法對(duì)脂肪、酸度、持水力、蛋白質(zhì)、蔗糖、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌、乳桿菌、感官評(píng)分共9個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，確定發(fā)酵條件。

1.3.3 Plackett-Burman試驗(yàn)

將菌粉添加量、白砂糖添加量、紅參粉添加量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度作為考察因素，感官評(píng)分作為響應(yīng)值，進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平Table 1 Plackett-Burman test factor level

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇因素A、B和C作為自變量，感官評(píng)分（Y）作為因變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)（Box-Behnken）設(shè)計(jì)見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平Table 2 Box-Behnken test factor level table

1.3.5 紅參酸乳品質(zhì)評(píng)價(jià)

將相同條件下未添加參粉的酸乳作為對(duì)照（CK），與紅參酸乳進(jìn)行品質(zhì)對(duì)比，測(cè)定指標(biāo)包括人參皂苷、脂肪和蛋白質(zhì)等。

1.3.5.1 指標(biāo)測(cè)定

脂肪含量測(cè)定參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》[17]；蔗糖含量測(cè)定參照GB 5009.8—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》[18]；酸度參照GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》[19]；蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[20]；非脂乳固體含量測(cè)定參照GB 5413.39—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品中非脂乳固體的測(cè)定》[21]；微生物測(cè)定參照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[22]；人參皂苷測(cè)定采用超聲提取-高效液相色譜法[23]。

1.3.5.2 感官評(píng)價(jià)

選10位同學(xué)對(duì)紅參酸乳的色澤、組織狀態(tài)和滋味、氣味進(jìn)行綜合評(píng)分[24]，取均值，具體標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 紅參酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory score criteria of red ginseng yogurt

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用 IBM SPSS Statistics 25.0、Design-Expert 8.0.6、WPS Office等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 菌粉添加量的確定

主成分分析是利用降維的方式，旨在將多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)綜合指標(biāo)的一種多變量數(shù)據(jù)最佳綜合簡(jiǎn)化方法[25]。不同菌粉添加量主成分分析結(jié)果見表4。

表4 不同菌粉添加量綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 4 Comprehensive index coefficient and contribution rate of different bacterial powder

由表4可知，主成分1、主成分2和主成分3的貢獻(xiàn)率分別為37.18%、28.37%、18.71%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到84.26%，其特征值分別為3.35、2.55和1.68。綜合評(píng)價(jià)值（D值）見圖1。

圖1 不同菌粉添加量的綜合評(píng)價(jià)值Fig.1 Comprehensive evaluation value of different bacterial powder supplemental levels

如圖1所示，不同菌粉添加量的最高綜合評(píng)價(jià)值為0.66，因此確定1.5 g為適宜菌粉添加量。

2.1.2 白砂糖添加量的確定

不同白砂糖添加量主成分分析結(jié)果見表5，綜合評(píng)價(jià)值（D值）見圖2。

表5 不同白砂糖添加量綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 5 Comprehensive index coefficient and contribution rate of different white sugar powder

圖2 不同白砂糖添加量綜合評(píng)價(jià)值Fig.2 Comprehensive evaluation value of different addition amounts of granulated sugar

由表5可知，主成分1和主成分2的累積貢獻(xiàn)率為77.88%，其中主成分1的貢獻(xiàn)率所占比重較大為54.26%。如圖2所示，18 g白砂糖所對(duì)應(yīng)綜合評(píng)價(jià)值最大，故選擇18 g為適宜白砂糖添加量。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間的確定

不同發(fā)酵時(shí)間主成分分析結(jié)果表6，綜合評(píng)價(jià)值（D值）見圖3。

表6 不同發(fā)酵時(shí)間綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 6 Different fermentation time comprehensive indicator coefficient and contribution rate

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間綜合評(píng)價(jià)值Fig.3 Comprehensive evaluation value of different fermentation time

由表6可知，主成分1的貢獻(xiàn)率和特征值分別為40.25%、3.62，主成分2的貢獻(xiàn)率和特征值分別為30.43%、2.74，主成分3的貢獻(xiàn)率和特征值分別為18.04%、1.62。如圖3所示，最大綜合評(píng)價(jià)值為0.95，故適宜發(fā)酵時(shí)間為6 h。

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

不同發(fā)酵溫度主成分分析結(jié)果見表7，綜合評(píng)價(jià)值（D值）見圖4。

由表7可知，主成分1和主成分2的累積貢獻(xiàn)率為75.39%，解釋了75%以上的信息。結(jié)合主成分1和2可知，發(fā)酵溫度對(duì)酸度、感官、乳桿菌和雙歧桿菌影響較大。如圖4所示，選擇最大綜合評(píng)價(jià)值所對(duì)應(yīng)的39℃為適宜發(fā)酵溫度。

表7 不同發(fā)酵溫度綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 7 Different fermentation temperature comprehensive indicator coefficients and contribution rates

圖4 不同發(fā)酵溫度綜合評(píng)價(jià)值Fig.4 Comprehensive evaluation value of different fermentation temperatures

2.1.5 紅參粉添加量的確定

不同紅參粉添加量主成分分析結(jié)果見表8，綜合評(píng)價(jià)值（D值）見圖5。

圖5 不同紅參粉添加量綜合評(píng)價(jià)值Fig.5 Comprehensive evaluation value of different red ginseng powder supplemental levels

表8 不同紅參粉添加量綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 8 Comprehensive index coefficient and contribution rate of different red ginseng powder

續(xù)表8 不同紅參粉添加量綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Continue table 8 Comprehensive index coefficient and contribution rate of different red ginseng powder

由表8可知，主成分1的貢獻(xiàn)率和特征值分別為60.26%和5.42；主成分2的貢獻(xiàn)率和特征值分別為22.37%和2.01。由圖5可知，不同紅參粉添加量的最大綜合評(píng)價(jià)值為0.76，故適宜紅參粉添加量為9.0 g。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)，結(jié)果見表9、表10。

表9 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果Table 9 Plackett-Burman test results

表10 Plackett-Burman方差分析Table 10 Variance analysis of Plackett-Burman

由表10可知，該模型顯著（P<0.05），表明建立模型有意義。結(jié)合F值和P值可知，紅參粉添加量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸乳的感官評(píng)分影響顯著，而菌粉添加量、發(fā)酵溫度和白砂糖添加量未達(dá)到顯著影響，表明其對(duì)于酸乳感官評(píng)分影響較小。因此結(jié)合單因素試驗(yàn)及F值、P值大小，綜合選擇A′、C′和D′共3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合上述試驗(yàn)，將感官評(píng)分作為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)（Box-Behnken）。試驗(yàn)結(jié)果見表11、表12。

表11 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 11 Box-Behnken test results

表12 Box-Behnken方差分析Table 12 Variance analysis of Box-Behnken

利用Design-Expert 8.0.6對(duì)表11數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到該模型的二次多元回歸方程為Y=86.84+3.43A-1.15B+0.98C-0.80AB+0.25AC-2.70BC-2.54A2-2.19B2-4.64C2。

由表12可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）；相關(guān)系數(shù) R2=0.974 0、校正決定系數(shù) R2Adj=0.940 6，以上數(shù)據(jù)表明模型具有較高擬合度。在該回歸模型中，因素A、交互項(xiàng)BC及二次項(xiàng)A2、B2、C2的P值均小于0.01，影響極顯著；因素B、C的P值分別為0.0183和0.035 7，小于0.05，表明影響顯著。根據(jù)3個(gè)因素的F值可知，各因素對(duì)紅參酸乳感官評(píng)分的影響順序依次為A＞B＞C，即發(fā)酵時(shí)間＞紅參粉添加量＞菌粉添加量。

2.3.2 響應(yīng)面分析圖

響應(yīng)面分析圖是由響應(yīng)值和試驗(yàn)因素組成的立體曲面圖，因素間交互作用對(duì)紅參酸乳的響應(yīng)面圖見圖6。

由圖6可知，響應(yīng)曲面皆開口向下，表明感官評(píng)分隨著發(fā)酵時(shí)間、菌粉添加量和紅參粉添加量各因素的增加而先增大后減小，表明存在感官評(píng)分最大值。其中紅參粉添加量和菌粉添加量交互作用的響應(yīng)面曲圖較陡，且等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明紅參粉添加量與菌粉添加量交互作用對(duì)酸乳感官評(píng)分影響極顯著。經(jīng)分析可得，紅參酸乳的優(yōu)化工藝為紅參粉添加量8.12 g、發(fā)酵時(shí)間7.56 h、菌粉添加量1.65 g，感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為88.656。

圖6 各因素間交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.6 The effect of interaction between factors on sensory scores

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)際操作，將工藝參數(shù)調(diào)整為紅參粉添加量8.1 g、菌粉添加量1.7 g和8 h的發(fā)酵時(shí)間，取3次驗(yàn)證試驗(yàn)的均值為88.2與預(yù)測(cè)值接近，表明工藝參數(shù)的可行性。

2.4 紅參酸乳品質(zhì)評(píng)價(jià)

紅參酸乳理化指標(biāo)對(duì)比見表13，微生物指標(biāo)對(duì)比見表14。

表14 紅參酸乳微生物指標(biāo)對(duì)比Table 14 Comparison of microbial indicators of red ginseng yogurt

由表13、表14可知，紅參酸乳的各項(xiàng)理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)均符合國(guó)家發(fā)酵乳標(biāo)準(zhǔn)，且優(yōu)于同等條件CK。

紅參酸乳皂苷含量見圖7。

圖7 紅參酸乳皂苷含量Fig.7 The content of ginsenoside in red ginseng yogurt

如圖7所示，紅參酸乳與水溶液的皂苷種類相同，但含量有所不同。紅參酸乳中Rb1含量為2.19mg/g、Rb2含量為 0.95 mg/g、Rc 含量為 1.20 mg/g、Rh2含量為0.07mg/g、Rg3含量為 0.23mg/g、Rg1+Re含量為 2.51mg/g。此外，皂苷Rd含量增加了37.84%，為1.52 mg/g。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)紅參酸乳工藝進(jìn)行研究，最佳工藝為8.1 g紅參粉、1.7 g菌粉、18 g白砂糖加入300 mL牛奶，于39℃恒溫發(fā)酵8 h。該工藝所得酸乳不僅酸甜適宜，且風(fēng)味獨(dú)特。此外，紅參粉的添加不僅增加了酸乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)使其兼具了中藥活性成分的功效，為人參在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供方向。