超聲波輔助纖維素酶提取黃瓜皮色素工藝研究

高一帆，李若思，吉莉，孫紅艷*

（1.太原科技大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，山西 太原 030024；2.太原科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030024）

石油化工合成色素已廣泛應(yīng)用于各種食品中，但其會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生不利影響，因此科學(xué)界必須探索更安全、自然和生態(tài)友好的色素。水果、蔬菜的果皮、種子、果渣等副產(chǎn)品中含有豐富的花青素、類胡蘿卜素、葉綠素等天然色素[1-3]，其安全且具有潛在價(jià)值，在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用[4-5]。為了滿足日漸增長(zhǎng)的社會(huì)需求，如何高效、便捷、充分提取天然色素，已成為色素生產(chǎn)的關(guān)鍵問(wèn)題[6-10]。

索氏提取技術(shù)、浸漬或氫蒸餾等[11]傳統(tǒng)提取天然色素的方法提取率較低、過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)且成本高。因此，需要?jiǎng)?chuàng)新技術(shù)。研究報(bào)道，超聲波輔助纖維素酶技術(shù)因其對(duì)溶劑要求極低、快速、方便、可提高提取率、保護(hù)色素不被降解等優(yōu)點(diǎn)而受到人們的青睞，此外，乙醇被認(rèn)為是很好的綠色提取溶劑，其對(duì)人類健康無(wú)影響且不會(huì)造成環(huán)境污染，受到大眾喜愛(ài)[12-15]。

黃瓜是葫蘆科的一種暖季型蔬菜[16]，其清香爽口、耐儲(chǔ)存，是人們食用較多的一類菜肴[17]。其中，黃瓜果皮含有大量的天然色素（類胡蘿卜素及葉綠素）。然而，現(xiàn)有研究對(duì)黃瓜農(nóng)副食品廢棄物的價(jià)值化探索甚少，黃瓜果皮并不為人類所消耗，每天產(chǎn)生的大量黃瓜皮被當(dāng)作垃圾處理，會(huì)造成污染源[17-18]，對(duì)其進(jìn)行資源利用很有必要。

此外，尚未有利用超聲波輔助纖維素酶提取黃瓜果皮中色素的研究。因此，本研究以黃瓜皮為原料，通過(guò)超聲波輔助酶解提取黃瓜皮中的色素，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，確定最佳的提取工藝并測(cè)定該條件下提取的色素含量，以期為黃瓜皮的進(jìn)一步加工利用提供一定技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃瓜：市售。95%乙醇（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶（10萬(wàn)U/g）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（ME54T）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9030MBE）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（FW80）：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；紫外分光光度計(jì)（UV-2600i）：島津儀器（蘇州）有限公司；高速臺(tái)式離心機(jī)（5430R）：艾本德（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司；超聲波恒溫水?。⊿CQHD300A）：上海聲彥超聲波儀器有限公司；恒溫?fù)u床（BILON-COS-100B）：上海比朗儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

挑選成熟度好且無(wú)損傷的新鮮黃瓜，充分清洗干凈，并使其皮肉分離，在剔取黃瓜皮時(shí)應(yīng)注意盡量減少黃瓜果肉的連帶量，以減少測(cè)量誤差；盡可能將得到的果皮切成小塊（1 cm×1 cm）；然后將切好的黃瓜皮置于50℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行烘干，粉碎過(guò)篩（60目），得到黃瓜皮粉，并放入4℃冰箱保存。

1.3.2 提取色素方法

將制備好的黃瓜皮粉置于10 mL具塞玻璃試管中，加入9 mL 95%乙醇。懸浮液用超聲波恒溫水?。ǔ暅囟?0℃、超聲功率250 W）提取，然后將纖維素酶溶解于其中，將獲得的混合液在恒溫培養(yǎng)搖床（溫度50℃、120 r/min）中孵育20 min，再將該混合液離心（8 500 r/min、10 min），分層后取上清液，并將其放在4 ℃冰箱中避光浸提 24 h[12，19]。

1.3.3 色素含量及提取量的測(cè)定

1.3.3.1 黃瓜皮色素含量的測(cè)定

將浸提液置于離心機(jī)中離心（8500r/min、10min），取3 mL上清液，用紫外分光光度計(jì)，測(cè)定在649、665、470nm的吸光度[19]，并根據(jù)下列相關(guān)公式計(jì)算色素含量，單位為mg/L，公式如下。

式中：Chl a為黃瓜果皮中葉綠素a的含量，mg/L；Chl b為黃瓜果皮中葉綠素b的含量，mg/L；Car為黃瓜果皮中類胡蘿卜素的含量，mg/L。

1.3.3.2 黃瓜皮色素提取量的計(jì)算

依照下列公式計(jì)算浸提液中黃瓜皮色素的提取量。

黃瓜皮色素提取量/（mg/g）=C×V/m

式中：C為提取液中黃瓜皮色素質(zhì)量濃度，g/mL；V為提取液體積，mL；m為黃瓜皮的質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

根據(jù)1.3.1制備黃瓜皮樣品，分別精準(zhǔn)稱取0.1 g進(jìn)行試驗(yàn)，按照1.3.2中的提取方法，對(duì)黃瓜皮中的色素進(jìn)行浸提，并依照1.3.3中的方法及公式計(jì)算黃瓜皮色素的提取量，通過(guò)所得數(shù)據(jù)篩選出各單因素的最適條件。纖維素酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、料液比[1 ∶30、1 ∶50 、1 ∶70 、1 ∶90、1 ∶110（g/mL）]、乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、45%、60%、75%、90%）以及超聲時(shí)間（60、90、120、150、180 min）為所檢測(cè)的因素。

1.3.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)纖維素酶添加量、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間4個(gè)因素分別取3個(gè)平，按照L9（34）正交表進(jìn)行優(yōu)化組合試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and horizontal design of orthogonal experiments

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本研究中所有試驗(yàn)各重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶添加量對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響

纖維素酶添加量對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響Fig.1 Effect of cellulase addition amount on extraction rates of pigment about cucumber peel

有研究表明，應(yīng)用纖維素酶可以降解細(xì)胞壁成分，是一種高效溫和的促進(jìn)色素提取的方法。因?yàn)槔w維素是植物細(xì)胞壁的關(guān)鍵組成，因此纖維素酶經(jīng)常被使用。此外，該酶即使在環(huán)境溫度和提取時(shí)間較短的情況下也能有效防止色素降解[22]。因此，利用纖維素酶能較充分地提取黃瓜皮中的色素。

由圖1可知，類胡蘿卜素、葉綠素b和葉綠素a的變化情況大致相同，隨著纖維素酶添加量的升高，色素提取量呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)纖維素酶添加量為0.8%時(shí)，提取量達(dá)到頂點(diǎn)，3種色素提取量分別為132.04（類胡蘿卜素）、66.31（葉綠素 b）、73.35 mg/g（葉綠素a），但當(dāng)纖維素酶添加量超過(guò)0.8%時(shí)，色素提取量均下降。這說(shuō)明，適量添加纖維素酶可以提高黃瓜皮的色素提取量，且纖維素酶添加量為0.8%時(shí)，纖維素酶對(duì)黃瓜皮的細(xì)胞壁破壞最嚴(yán)重。魯青等[23]研究當(dāng)纖維酶添加量為0.2%時(shí)，其對(duì)火龍果皮中甜菜紅素的提取非常有效，其提取量達(dá)到最高（37.22%），該研究表明，火龍果皮的色素提取率與纖維素酶添加量不會(huì)呈顯著的正相關(guān)，其研究與本研究的結(jié)果一致。酶解反應(yīng)不徹底是由于纖維素酶添加量過(guò)低而引起的，只有適當(dāng)提高纖維素酶添加量，才能使反應(yīng)進(jìn)行徹底，但纖維素酶添加量過(guò)大，反而約束酶發(fā)揮其效應(yīng)[24]。故本研究最適纖維素酶添加量為0.8%。

2.2 料液比對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響

料液比不同會(huì)影響提取液中提取劑的用量，料液比會(huì)使傳質(zhì)推動(dòng)力有所差異，提取劑用量大就會(huì)使傳質(zhì)推動(dòng)力大，則提取更快，提取量更高，因此，料液比對(duì)色素提取量有重要的作用。料液比對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction rates of pigment about cucumber peel

由圖2可知，隨著溶液體積的增大，黃瓜皮的色素提取量先增后減，當(dāng)料液比為1∶90（g/mL）時(shí)，獲得最大提取量，分別為169.12（類胡蘿卜素）、68.04（葉綠素b）、91.81 mg/g（葉綠素 a），當(dāng)料液比為1 ∶110（g/mL）時(shí)，3種色素提取量均下降。張麗等[24]利用纖維素酶輔助超聲波法提取茄子皮中的色素，其研究表明，隨著料液比的降低，茄子皮色素的提取量提升，當(dāng)料液比為1∶60（g/mL）時(shí)達(dá)到頂峰，但超過(guò)該值，茄子皮色素提取量反而下降，其結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因是由于料液比過(guò)大會(huì)稀釋色素的濃度，因而會(huì)使色素的提取量降低。故本研究中的料液比應(yīng)控制在 1∶90（g/mL）為宜。

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響

相比于甲醇、丙酮等，乙醇為綠色環(huán)保有機(jī)溶劑，不污染環(huán)境且對(duì)人體健康無(wú)害，提取效率高，價(jià)格低廉，因此非常適合用作食品色素提取劑。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction rates of pigment about cucumber peel

由圖3可知，類胡蘿卜素、葉綠素b和葉綠素a的變化趨勢(shì)一樣，當(dāng)其他條件維持不變時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，3種色素提取量均顯示出先增后減的結(jié)果。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)，類胡蘿卜素、葉綠素b及葉綠素a的提取量均達(dá)到最大值（186.69、69.94、117.34 mg/g）。然而一旦乙醇的體積分?jǐn)?shù)超過(guò)75%，黃瓜皮的色素提取量均降低。該結(jié)果與俞騰飛等[25]報(bào)道的乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄籽花青素提取的研究相同，說(shuō)明當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)其適宜范圍時(shí)，會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)一些醇溶性雜質(zhì)，其與乙醇、水分子等結(jié)合后，會(huì)與色素的溶解形成競(jìng)爭(zhēng)，從而引起色素提取量的降低[19]。上述結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)提取色素的效率最佳。

2.4 超聲時(shí)間對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響

據(jù)報(bào)道，超聲波在食品加工中的應(yīng)用可提高色素提取量，因?yàn)樗苡行У卦黾觽髻|(zhì)傳熱。事實(shí)上，由于空化現(xiàn)象[26]，隨著細(xì)胞壁的破壞和細(xì)胞材料的釋放，萃取過(guò)程可以得到加強(qiáng)。超聲時(shí)間對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響如圖4所示。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rates of pigment about cucumber peel

由圖4可知，類胡蘿卜素、葉綠素b和葉綠素a的變化趨勢(shì)類似，在其他條件保持恒定時(shí)，若超聲時(shí)間延長(zhǎng)，色素提取量會(huì)表現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，超聲時(shí)間在120min處可達(dá)到最高值。本研究結(jié)果與羅璇等[27]、東子珺等[28]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短均會(huì)對(duì)植物的色素提取造成不良影響。若時(shí)間太短，則會(huì)致使提取不充分，甚至不會(huì)激活酶的活性；若時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致色素?fù)p失，兩者均會(huì)降低色素提取效果。綜上所述，超聲時(shí)間最好維持在120 min左右。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

以各單因素試驗(yàn)（纖維素酶添加量、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間）為基礎(chǔ)，對(duì)黃瓜皮的3種色素提取量進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)見(jiàn)表2。

表2 黃瓜皮色素提取的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments for extracted pigment of cucumber peel

由表2可知，雖然各因素對(duì)黃瓜皮色素的提取量趨勢(shì)相同，但基于R值，A、B、C、D 4個(gè)因素對(duì)黃瓜皮色素提取量的影響效果不同，結(jié)果表明，其主次順序?yàn)锳>C>B>D，即對(duì)黃瓜皮色素提取量影響最顯著的是纖維素酶添加量，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比，而超聲時(shí)間對(duì)其色素提取量影響微弱。黃瓜皮色素的最優(yōu)提取工藝條件為A2B2C3D1，在該條件下黃瓜皮色素的提取量分別為137.83（類胡蘿卜素）、69.52（葉綠素b）、76.54 mg/g（葉綠素 a）。

綜上所述，在黃瓜皮色素提取過(guò)程中，考慮到成本和提取效果問(wèn)題，應(yīng)該選擇在最適合的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，即纖維素酶添加量0.8%、料液比1∶90（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、超聲時(shí)間90 min。為確保試驗(yàn)的精準(zhǔn)性，對(duì)上述最優(yōu)提取工藝條件（A2B2C3D1）進(jìn)行了3次重復(fù)，黃瓜皮的類胡蘿卜素提取量分別為136.92、137.24、138.45 mg/g，平均值為137.54 mg/g；葉綠素b的提取量分別為 69.03、69.24、69.80 mg/g，平均值為69.36 mg/g；葉綠素a的提取量分別為76.00、76.23、76.85 mg/g，平均值為76.36 mg/g，以上數(shù)據(jù)同正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致，因此該正交試驗(yàn)結(jié)果可信。

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)纖維素酶添加量、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)以及超聲時(shí)間的綜合優(yōu)化，確定了最佳提取條件為纖維素酶添加量0.8%、料液比1∶90（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、超聲時(shí)間90 min。其影響效果依次為：纖維素酶添加量>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>超聲時(shí)間。在此條件下從黃瓜皮中提取得到的類胡蘿卜素含量為137.54 mg/g，葉綠素b含量為69.36 mg/g，葉綠素a含量為76.36 mg/g。分別比優(yōu)化前增加了5.79、3.21、3.19 mg/g。

本研究采用了綠色新型、對(duì)人體健康無(wú)害的技術(shù)——超聲波輔助纖維素酶法提取黃瓜皮中的色素（類胡蘿卜素、葉綠素b、葉綠素a），該法被認(rèn)為是一種合適的工業(yè)方法，可獲得較高的提取量。此外，從廉價(jià)的加工廢棄物中生產(chǎn)天然有價(jià)值的著色劑，可能會(huì)產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。