Microbulbifer salipaludis褐藻膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

張文立，王鑫繡，徐煒，劉曉勇，沐萬孟*

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.山東海之寶海洋科技有限公司，山東 威海 264333）

海洋的水體環(huán)境具有高鹽、高壓、低溫、寡營養(yǎng)的特點，因此賦予了海洋生物更多特殊的生理功效，是人類膳食營養(yǎng)和生物醫(yī)藥的巨大資源寶庫。以海洋糖類為代表的海洋食品和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)等新型產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，為我國海洋產(chǎn)業(yè)的結(jié)構(gòu)升級和可持續(xù)發(fā)展注入了新的動力。

褐藻有超過250個屬，約1 800余種，是我國十分重要的經(jīng)濟(jì)藻類[1]。褐藻膠是廣泛存在于各種褐藻中的一類多糖物質(zhì)，由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid，M）和 α-L-古羅糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）通過1，4-糖苷鍵聚合而成的線性多糖[2]，可以形成多聚甘露糖醛酸片段、多聚古羅糖醛酸片段和甘露糖醛酸-古羅糖醛酸混合片段。不同藻類來源的褐藻膠M與G的比值不同，其成膠性、離子結(jié)合能力、流動性等理化性質(zhì)也各不相同[1]。褐藻膠水溶液黏度高，常被用作增稠劑、穩(wěn)定劑、賦形劑等應(yīng)用到食品行業(yè)中[3]。然而，褐藻膠分子量大，導(dǎo)致其水溶性差和生物利用度低，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用范圍。褐藻寡糖，是一種聚合度在2～25的分子，由褐藻膠分解而成[4]，具有調(diào)節(jié)人體免疫、抗氧化、抗腫瘤、抑菌、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、促進(jìn)植物生長等多種功能[5-6]。由于褐藻寡糖具有良好的水溶性、較強(qiáng)的穩(wěn)定性、高生物利用度和安全無毒等特點，因此廣受國內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注。

褐藻寡糖的生產(chǎn)主要包括化學(xué)分解法、物理分解法和生物酶法[7-9]。化學(xué)物理方法主要包括酸水解法、H2O2法[10]、臭氧法[11]、輻照法等，但存在耗能大、副產(chǎn)物復(fù)雜等問題。與化學(xué)物理法生產(chǎn)的寡糖片段在兩個末端都具有未修飾的己糖醛酸殘基不同的是，酶法能生成含有不飽和雙鍵還原末端的寡糖，反應(yīng)副產(chǎn)物少、耗能低、產(chǎn)物生物活性高，具有很高的應(yīng)用價值。在褐藻寡糖的生物轉(zhuǎn)化中，褐藻膠裂解酶（alginate lyase，aly）發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

褐藻膠裂解酶，是一種多糖裂解酶，通過β消除機(jī)制催化1，4-糖苷鍵發(fā)生水解，然后在斷裂后新生成的C4-羥基處發(fā)生C4與C5間的脫去反應(yīng)，生成非還原性末端的C4-C5雙鍵[12]。該雙鍵與C5-羧羰基形成共軛結(jié)構(gòu)，在紫外230 nm～240 nm處有特征性的強(qiáng)吸收。褐藻膠裂解酶有多種分類方式，以不同底物偏好性可分為聚甘露糖醛酸（polyM）特異性酶、聚古羅糖醛酸（polyG）特異性酶和雙功能酶[13]；以反應(yīng)方式可分為內(nèi)切酶和外切酶[12]；以分子量大小可分為小型（25 kDa～30 kDa）、中型（約 40 kDa）和大型裂解酶（＞60 kDa）[14]。褐藻膠裂解酶用途廣泛，除去降解褐藻膠生產(chǎn)褐藻寡糖作為食品與農(nóng)業(yè)原料[15-18]，在醫(yī)學(xué)上還可以被加入到抗菌藥物中協(xié)助對銅綠假單胞菌感染的治療[19-20]。

微泡菌屬鹽田微泡菌（Microbulbifer salipaludis，Misa）的全基因組序列已經(jīng)解析，并公布在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，編號為NZ_JAEKJR-010000001。在M.salipaludis的全基因組序列中，存在一段編碼褐藻膠裂解酶的假定基因，GenBank登錄號為WP_207000102.1。本研究合成了M.salipaludis褐藻膠裂解酶假定基因片段，插入pET-22b（+）表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至Escherichia coli BL21（DE3）進(jìn)行異源表達(dá)。隨后進(jìn)行蛋白分離純化和酶學(xué)性質(zhì)鑒定，證實重組酶屬于褐藻膠裂解酶（命名為Misa-aly）。本研究為褐藻寡糖的生物轉(zhuǎn)化提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表達(dá)宿主 E.coliBL21（DE3）、克隆宿主 E.coliDH5α：生工生物工程（上海）股份有限公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（β-d-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（bovine serum albumin，BSA）、瓊脂糖、4S Green Plus無毒核酸染料、海藻酸鈉：大連Takara公司；SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒（12.5%）、蛋白Loading Buffer（5×）、蛋白Marker：上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；polyM、polyG：青島博智匯力生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge5804R型高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；SCIENTZ-IID型超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；CFX-96型實時熒光定量PCR儀、蛋白電泳儀系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；Tanon 2500型凝膠成像分析系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；Infinite F50型酶標(biāo)儀：瑞士Tecan公司；Quattro Premier XE三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀：美國WATERS公司；Free－Zone 6 L立式冷凍干燥機(jī)：美國LABCONCO公司。

1.3 方法

1.3.1 Misa-aly重組質(zhì)粒構(gòu)建

合成編碼來源于Microbulbifer salipaludis的假定褐藻膠裂解酶的基因片段，利用SignalP 5.0在線網(wǎng)站預(yù)測信號肽位置并切除，同時將6個組氨酸標(biāo)簽添加到目的基因片段的C末端，以簡化后續(xù)重組酶的分離純化步驟。將目的基因片段插入表達(dá)載體pET-22b（+）的Nde I和Xho I酶切位點之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pET22b-Misa。利用熱激法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21（DE3），獲得轉(zhuǎn)化子。

1.3.2 誘導(dǎo)表達(dá)

挑取1.3.1中的轉(zhuǎn)化子單菌落接種于4 mL的LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h；以2%接種量轉(zhuǎn)接至200 mL的LB培養(yǎng)基（Amp 100 μg/mL），37℃、200 r/min培養(yǎng)3 h～4 h。培養(yǎng)至OD600約0.6～0.8后，添加終濃度1 mmol/L的IPTG，在28℃、200 r/min下誘導(dǎo)表達(dá)6 h。

1.3.3 表達(dá)純化

將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液在25℃、6 000 r/min條件下離心5 min，收集菌體，超聲破碎后4℃、8 000 r/min離心10 min除去細(xì)胞碎片，用0.45 μm水系濾膜過濾上清液中的雜質(zhì)，得到粗酶液，冰浴放置。

利用Ni2+親和層析柱收集上清液中的重組酶，隨后將上述得到的重組酶溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為10 kDa的透析袋中，用10 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA-2Na） 的 Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH8.0）在 4℃下透析 6 h，以除去重組酶溶液中的咪唑以及其他金屬離子。再將透析袋轉(zhuǎn)移至50 mmol/L Tris-HCl pH8.0緩沖液中透析12 h，每6 h更換一次透析液，以去除EDTA。透析結(jié)束后，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。純化后的酶液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）純度驗證。

1.3.4 酶活力和蛋白含量測定

蛋白含量的測定使用BCA試劑盒，以牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在560 nm下定量測定樣品蛋白濃度。

采用 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定酶活力：取適當(dāng)稀釋的反應(yīng)液加入兩倍體積DNS試劑，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫約25℃，加入3倍體積水稀釋后，560 nm波長下測定吸光度。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，計算反應(yīng)生成還原糖的量。酶活力單位（U）定義為每分鐘生成1 μmol還原糖所需要的酶量。

1.3.5 酶學(xué)性質(zhì)測定

1）酶反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系：終濃度0.35%的海藻酸鈉，100 mmol/L 的 NaCl，5 μg/mL 的重組酶，50 mmol/L 的Tris-HCl緩沖液（pH 8.5）。

2）酶反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)條件：在45℃的恒溫水浴中進(jìn)行酶反應(yīng)，準(zhǔn)確計時5 min后立即將反應(yīng)體系加入2倍體積的DNS顯色液，結(jié)束酶反應(yīng)。

1.3.5.1 最適pH值的測定

選用50 mmol/L不同pH值的緩沖液（磷酸鈉緩沖液，pH 6.0～7.5；Tris-HCl緩沖液，pH 7.5～9.0；甘氨酸-NaOH緩沖液，pH 9.0～10.5），按照DNS法測定不同pH值下的褐藻膠裂解酶酶活力，以最大酶活力為100%，分別計算各pH值條件下的相對酶活。

1.3.5.2 最適反應(yīng)溫度的測定

在 Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8.5）條件下，采用DNS法測定不同溫度下（35℃～60℃）褐藻膠裂解酶活力，以最大酶活力為100%，分別計算各溫度處理條件下的相對酶活。

1.3.5.3 最適NaCl濃度的測定

在Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH8.5），45℃反應(yīng)體系下，分別添加終濃度為0、25、50、100、200、400mmol/L的NaCl，采用DNS法測定不同NaCl濃度的酶活力，以最高酶活力為100%，計算各濃度的相對酶活。

1.3.5.4 熱穩(wěn)定性的測定

對酶液適當(dāng)稀釋至一定濃度并加入100 mmol/L的NaCl后，在40、45℃和55℃下分別保溫1 h，間隔定時取樣，在最適溫度下采用DNS法測定殘余酶活，以未處理的酶液為對照（100%），分別計算各溫度處理后的相對殘余酶活。

1.3.6 底物特異性及產(chǎn)物組成

將海藻酸鈉、polyM、polyG分別作為底物測定酶活力，底物質(zhì)量濃度均為0.35%。最適反應(yīng)條件下，采用DNS法測定酶活力，將海藻酸鈉組酶活力設(shè)為100%，測定不同底物時的比酶活。

9月14日，遼寧省政府發(fā)布《遼寧省集中式飲用水水源地保護(hù)攻堅戰(zhàn)實施方案》，要求自10月起，遼寧省地級及以上城市集中式飲用水水源水質(zhì)至少每月向社會公開1次；縣級集中式飲用水水源水質(zhì)應(yīng)至少每季度向社會公開一次。到2020年，全省地級及以上城市集中式飲用水水源地得到全面有效保護(hù)。地級及以上城市集中式飲用水水源水質(zhì)優(yōu)良比例達(dá)到96.3%。強(qiáng)力推進(jìn)縣級及以上城市集中式飲用水水源地規(guī)范化建設(shè)，基本解決縣級及以上城市集中式飲用水水源保護(hù)區(qū)內(nèi)各類環(huán)境違法問題。加強(qiáng)農(nóng)村飲用水水源地保護(hù)，完成鄉(xiāng)級集中式飲用水水源保護(hù)區(qū)的劃定。

在 Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8.5），40 ℃標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下，以終濃度1%的海藻酸鈉作為底物，加過量酶充分反應(yīng)24 h。加入4倍體積無水乙醇混合沉淀除去殘余多糖與蛋白，8 000 r/min離心10 min，取上清液旋蒸濃縮去除乙醇，冷凍干燥后復(fù)溶至濃度為0.1 mg/mL，通過液相-質(zhì)譜（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）檢測產(chǎn)物組成。

向1%海藻酸鈉標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中加入5 μg/mL酶，40℃分別反應(yīng)12 h和24 h，煮沸滅酶后通過0.22 μm過膜后凍干，以凍干產(chǎn)物質(zhì)量與底物總質(zhì)量之比計算轉(zhuǎn)化率。

液相色譜條件：色譜儀WATERS ACQUITY UPLC；BEH C18分析柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）。流動相：A乙腈，B 0.1%甲酸；梯度洗脫程序：0～40 min，0%流動相A，100%流動相B；40 min～45 min，流動相A從 0%變到30%，流動相B從100%變到70%；45 min～50 min，流動相A從30%變到80%，流動相B從70%變到20%；50 min～55 min，流動相A從80%變到100%，流動相B從 20%變到 0%；柱溫：45℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。

MS檢測條件：離子方式為電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）負(fù)模式 ；毛細(xì)管電壓 3.0 kV；錐孔電壓20 V；離子源溫度100℃；去溶劑化溫度400℃；脫溶劑氣流量700 L/h；錐孔氣流量50 L/h；碰撞能量6 eV；質(zhì)量范圍 m/z 50～2 000；電壓 1 800 V。

1.4 數(shù)據(jù)處理

蛋白電泳圖使用Adobe Photoshop 2021軟件處理；序列對比使用CLUSTAL OMEGA與ESPript 3.0在線網(wǎng)站作圖；相關(guān)酶活力數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel計算，使用Originlab Origin 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆表達(dá)與同源性分析

M.salipaludis的基因片段JF535_RS01340經(jīng)預(yù)測，可能編碼褐藻膠裂解酶（WP_207000102.1），命名為Misa-aly。與已報道的一種屬于PL7家族來源于Microbulbifer sp.的裂解酶（AlgSH7，登錄號 QID05195.1）[21]比對，蛋白序列相似度為73.90%。圖1為Misa-aly與其他幾個PL7家族褐藻膠裂解酶的序列比對圖。

圖1 褐藻膠裂解酶的氨基酸序列比對分析Fig.1 Multiple sequence alignment of amino acids from aly

PL7家族具有高度保守的區(qū)域SA3（RXEXR）、SA4（YXKAGXYXQ）、SA5（QXH），這些區(qū)域同樣可以在Misa-aly序列內(nèi)找到。序列比對分析結(jié)合酶學(xué)性質(zhì)鑒定，可以證實該酶屬于PL7家族中一種新的褐藻膠裂解酶。

2.2 蛋白表達(dá)純化

Misa-aly全細(xì)胞與純酶電泳圖見圖2。

圖2 Misa-aly全細(xì)胞與純酶電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of of the whole cells and purified Misa-aly

2.3 酶學(xué)性質(zhì)鑒定

pH值和溫度對Misa-aly酶活的影響見圖3。

圖3 pH值和溫度對Misa-aly酶活的影響Fig.3 Effects of pH and temperature on Misa-aly activity

溫度和pH值是影響酶活力的重要條件之一。如圖3所示，Misa-aly的最適pH值為8.5（Tris-HCl緩沖液），與來自Microbulbifer sp.的褐藻膠裂解酶AlgSH7相似（最適pH 9.0，最適溫度40℃）[21]。絕大多數(shù)褐藻膠裂解酶的最適pH值為中性或弱堿性，只有少數(shù)為酸性。Misa-aly在弱堿性范圍內(nèi)相對酶活較高，pH8.0～9.0范圍內(nèi)相對酶活維持在80%以上。由于PL7家族褐藻膠裂解酶的產(chǎn)酶微生物大多來源于海洋，因此最適溫度通常為30℃～50℃。類似的，Misa-aly最適溫度為45℃，且對溫度較為敏感。40℃和50℃時的相對酶活力下降為61.0%和65.3%。通常而言，海藻酸鈉在堿性環(huán)境下溶解度增大、黏度下降，有利于生產(chǎn)；利用酶的冷適應(yīng)特性與敏感性，可以更精準(zhǔn)地控制啟動和終止催化反應(yīng)，有利于寡糖的精確生產(chǎn)調(diào)控[21]。

NaCl濃度對Misa-aly酶活的影響見圖4。

圖4 NaCl濃度對Misa-aly酶活的影響Fig.4 Effects of NaCl on Misa-aly activity

大多數(shù)褐藻膠裂解酶產(chǎn)酶微生物來自于海洋，因此Na+對褐藻膠裂解酶的催化活性具有一定的影響。如圖4所示，Misa-aly的最適NaCl濃度為100 mmol/L，在400 mmol/L的高鹽條件時相對酶活維持60%以上，而不額外添加Na+時相對酶活也超過50%。NaCl濃度在25 mmol/L～200 mmol/L，酶活都能在75%以上。褐藻膠作為一種海洋多糖，大多數(shù)研究表明褐藻膠裂解酶具有一定的Na+依賴性，如來自Vibrio splendidus OU02[22]、Microbulbifer thermotoleransDAU221[23]的褐藻膠裂解酶，不額外添加Na+時酶活力急劇下降。Misa-aly在不添加Na+時的較高活性，證明其對Na+的依賴性不強(qiáng)，這樣可以降低添加NaCl的原料成本，減少后續(xù)脫鹽環(huán)節(jié)，降低機(jī)械設(shè)備損耗。

在40、45℃和55℃下分別保溫處理酶液，測定Misa-aly的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖5。

圖5 不同溫度保溫對Misa-aly穩(wěn)定性影響Fig.5 Effect of temperature on the stability of Misa-aly

如圖5所示，Misa-aly在40℃以下時較為穩(wěn)定，40℃保溫1.0 h，殘余酶活保留50%以上；在45℃下保溫0.5 h，殘余酶活下降到35%以下。褐藻膠裂解酶家族中一大部分裂解酶來源于海洋細(xì)菌，通常在40℃以上溫度穩(wěn)定性較差[22-25]，具有典型的冷適應(yīng)性，易于在狹窄的溫度范圍內(nèi)控制反應(yīng)進(jìn)程，方便獲得需要的聚合度范圍的低聚糖。

2.4 Misa-aly底物特異性及產(chǎn)物組成

最適反應(yīng)條件下，分別以海藻酸鈉、polyM、polyG作為底物測定酶的催化活力，結(jié)果見圖6。

圖6 Misa-aly對不同底物的相對酶活力Fig.6 Substrate specificity of Misa-aly

由圖6可知，當(dāng)以海藻酸鈉為底物時，酶活力為（53.0±1.2）U/mg；以polyG和polyM為底物時的相對活力分別為海藻酸鈉的89.8%和273.8%，酶活力分別為（47.6±1.5）、（145.1±2.1）U/mg。與其他已研究的 PL7家族的褐藻膠裂解酶相似，Misa-aly也屬于polyM偏好酶。

充分裂解底物海藻酸鈉后，通過LC-MS對產(chǎn)物進(jìn)行褐藻寡糖組分分析，結(jié)果見圖7。

如圖7所示，海藻酸鈉經(jīng)Misa-aly酶解后，產(chǎn)物分別主要集中分布在3個峰內(nèi)（圖7a），3個峰的主要產(chǎn)物分別對應(yīng)質(zhì)荷比 351（圖 7b）、527（圖 7c）和 703（圖7d），即聚合度分別為DP2、DP3、DP4的褐藻寡糖，說明反應(yīng)最終裂解產(chǎn)物可以產(chǎn)生聚合度DP2～4的寡糖。1%（10 mg/mL）海藻酸鈉溶液在40℃下裂解反應(yīng)12 h后，還原糖濃度達(dá)到0.56 mg/mL（DNS法計），凍干計算轉(zhuǎn)化率為69.2%，24 h后凍干計算轉(zhuǎn)化率可達(dá)到94.7%。相比之下，rFlAlyA-aly酶解4h，轉(zhuǎn)化率為70.1%，效率較高[26]；但Misa-aly酶解24 h后，底物海藻酸鈉幾乎全部酶解，酶解更為徹底。

圖7 裂解產(chǎn)物總離子流圖與二糖、三糖、四糖對應(yīng)質(zhì)譜圖像Fig.7 The mass spectrum images of pyrolysis products，disaccharide，trisaccharide and tetrasaccharide

3 結(jié)論

本試驗篩選出一種來源于Microbulbifer salipaludis的新型褐藻膠裂解酶，合成了Misa-aly編碼基因，并實現(xiàn)了在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中的異源表達(dá)。經(jīng)分離純化后，研究了Misa-aly酶學(xué)性質(zhì)。以海藻酸鈉為底物，通過 DNS法測定酶活力為（53.0±1.2）U/mg，最適pH值為8.5（Tris-HCl緩沖液），最適溫度為45℃，40℃下半衰期約在1 h左右。Misa-aly對Na+依賴性較低，可以降低生產(chǎn)原料成本，減輕后續(xù)脫鹽工序環(huán)節(jié)的壓力，并降低機(jī)械設(shè)備損耗。Misa-aly屬于PL7家族多糖裂解酶，且底物偏好性為聚甘露糖醛酸（polyM）。在Misa-aly催化作用下，海藻酸鈉的裂解產(chǎn)物為DP2-4的寡糖，24 h后酶解轉(zhuǎn)化率達(dá)到94.7%，底物海藻酸鈉幾乎全部酶解，轉(zhuǎn)化率較高。因此，Misa-aly在褐藻寡糖的生物制備中具有一定的應(yīng)用前景。