長壽花葉片愈傷組織誘導及組培技術體系的建立

劉金霞，楊鑫宇，宋丹，張紅艷，閆芬芬*

（1塔里木大學園藝與林學學院/南疆特色果樹高效優(yōu)質栽培與深加工技術國家地方聯合工程實驗室，新疆，阿拉爾 843300）

（2昆玉市大漠田園農業(yè)發(fā)展有限公司，新疆，昆玉 848116）

長壽花(Kalanchoe blossfeldiana)是景天科伽藍菜屬多年生肉質草本花卉，原產馬達加斯加島［1］。其植株矮小，株型緊湊，葉片翠綠、花朵密集、花色豐富，花期從12月開至次年5月，是市場暢銷的盆栽觀賞花卉［1］。長壽花不僅耐旱性強，養(yǎng)護管理容易，而且應用廣泛，裝飾效果好，特別適用于微型盆栽及花壇布置等室內外栽培，是新疆乃至西北地區(qū)花卉市場的主角，具有良好的市場前景［2］。長壽花傳統的繁殖方法有扦插繁殖和播種繁殖，但這些方法繁殖率低，受環(huán)境影響大，且容易導致病毒的積累、使品種退化，進而影響長壽花的產量和品質，嚴重制約種苗的商品化生產［3-4］。采用組織培養(yǎng)的方法不僅可以提高長壽花的繁殖系數，實現規(guī)?；a，而且也可以實現脫毒處理，目前該方法已成為現代化種苗繁育的主要方式［5］。蘇惠等［6］利用長壽花的葉柄、莖段和莖尖進行組織培養(yǎng)，并獲得相應的培養(yǎng)配方。孫新政等［7］通過對白色長壽花莖段外植體進行了初代誘導、增殖、生根及移栽的研究發(fā)現，莖段培養(yǎng)可以作為離體繁殖長壽花的重要途徑。高建莉等［8］研究證明以長壽花葉片作為外植體誘導愈傷組織，其誘導時間比用葉柄和莖段短7 d。孫利娜［9］研究得出長壽花嫩葉片的最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，可縮短組培時間。本研究以紅色和黃色的重瓣長壽花成熟葉片為外植體，通過離體葉片誘導愈傷途徑研究成熟葉片的滅菌處理、葉片愈傷組織、不定芽及不定根的誘導技術。通過離體組織培養(yǎng)的方法繁殖高質量長壽花，提高長壽花繁殖系數，以期建立重瓣長壽花組培技術體系，為西北地區(qū)長壽花組培苗工廠化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自塔里木大學園藝實驗站盆栽長壽花成熟葉片，紅色品種為‘阿朱諾’，黃色品種為‘日出’。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體滅菌處理

取健壯、成熟的紅色和黃色重瓣長壽花葉片，流水沖洗數次，脫脂棉反復擦拭除塵后，在超凈工作臺內將葉片剪成1.0 cm2正方形小塊進行滅菌處理。先用75%乙醇溶液消毒30 s，再加入1%次氯酸鈉溶液滅菌處理［10］，其中紅色重瓣長壽花葉片分別設置3個滅菌時間處理：6 min、8 min、10 min；黃色重瓣長壽花葉片分別設置3個消毒時間處理：5 min、7 min、9 min。最后無菌水沖洗3次，將滅菌后的葉片切成約1 cm×1 cm的小塊接種于MS培養(yǎng)基上，每瓶放置5小塊，每個處理接種10瓶，重復50次。7 d后調查污染率、褐化率及葉片誘導狀態(tài)［11］。

1.2.2 愈傷組織的誘導

將滅菌后1 cm2的成熟葉片接種在不同激素配比的誘導愈傷組織培養(yǎng)基中（表1），每瓶放置5塊，每個處理水平接種6瓶，重復30次。25 d后觀測并記錄愈傷組織生長及增殖的情況。

表1 葉片愈傷組織誘導的激素配比處理 mg/L

1.2.3 不定芽的誘導

將培養(yǎng)28～35 d后生長狀況良好的黃綠色愈傷組織切成小塊，接種到不同激素配比誘導叢生芽的培養(yǎng)基上（表2），每瓶放置3小塊，每個處理水平接種5瓶，重復15次。接種35 d后進行芽增殖系數統計。

表2 不定芽誘導的激素配比處理 mg/L

1.2.4 不定根的誘導

待不定芽生長至2～3 cm時，將健壯的單株芽苗切下轉接至不同生根誘導培養(yǎng)基中（表3），每瓶放置3株，每個處理接種5瓶，重復15次，培養(yǎng)室中正常培養(yǎng)。25 d后調查并記錄根的生長狀況。

表3 不定根誘導的激素配比處理 mg/L

1.3 數據處理

采用WPS Office軟件對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌時間對長壽花葉片滅菌效果的影響

由表4可知，紅色重瓣長壽花成熟葉片在1%的次氯酸鈉溶液消毒處理時間為10 min時，葉片誘導成功率最高，為64.0%，污染率最低，為26.0%，主要為細菌污染。黃色重瓣長壽花葉片在次氯酸鈉滅菌處理9 min時，葉片誘導成活率最高，為60.0%，污染率最低，為28.0%，均為細菌污染。兩個花色成熟葉片在1%的次氯酸鈉溶液滅菌處理6～7 min時污染率達52%，滅菌時間為5 min時污染率極高，為82.0%。另外，隨著滅菌時間增加，葉片褐化程度明顯，由于葉片切割材料過小，傷口周圍褐化程度較高。因此認為，長壽花成熟葉片最佳的滅菌方式為75%酒精消毒30 s，再用1%的次氯酸鈉溶液消毒9～10 min，無菌水沖洗3次為宜。

表4 不同滅菌時間對長壽花葉片滅菌效果及外植體成活率的影響

2.2 不同激素配比對長壽花葉片愈傷組織誘導的影響

由表5可知，不同激素濃度配比對長壽花外植體愈傷組織誘導的能力不同。激素配比為MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L時對紅色和黃色的重瓣長壽花葉片愈傷組織的誘導效果最佳，紅色重瓣長壽花葉片誘導率達到80.0%，葉片形成的愈傷組織狀態(tài)為向上卷曲膨大、嫩綠色、細密、瘤狀的突起，誘導分化明顯。黃色重瓣長壽花葉片誘導率為86.7%，在此培養(yǎng)基下，葉片形成的愈傷組織為嫩綠色、細密、有瘤狀傷口，誘導分化明顯。另外，高濃度的6-BA要比低濃度的誘導效果好，6-BA濃度相同時，高濃度的NAA更利于愈傷組織的形成和分化。

表5 不同激素配比對長壽花外植體愈傷組織誘導的影響

2.3 不同激素配比對愈傷組織誘導不定芽的影響

2.3.1 不同激素配比對長壽花葉片愈傷組織誘導不定芽的影響

由表6可知，不同激素濃度配比對長壽花叢生芽誘導的能力不同，其中MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L為最佳激素配比。在此激素誘導下，長壽花愈傷組織誘導叢生芽的效果最好，其中紅色長壽花的增殖系數為2.93，黃色長壽花的增殖系數為2.87，且誘導出的叢生芽多、芽體肥大、長勢旺盛，培養(yǎng)后期芽體不會變黃。6-BA濃度相同時，IBA濃度越高，誘導增殖系數越??；IBA濃度相同時，6-BA濃度越高，誘導增殖系數越大，因此認為高濃度的6-BA和低濃度的IBA對叢生芽誘導的效果更好。但是不同濃度的NAA對叢生芽誘導效果的影響不大。兩種花色重瓣長壽花在相同激素濃度配比下誘導效果差異不明顯，可見不同花色外植體對叢生芽誘導的差異不明顯。

表6 不同激素配比對長壽花愈傷組織誘導不定芽的影響

2.3.2 不同誘導時間對叢生芽誘導的影響

在最佳激素配比條件下，誘導時間不同。叢生芽誘導效果不同（圖1）。在誘導時間為0～30 d時，A2、A3、A4對叢生芽誘導率均呈上升趨勢，但誘導效果存在差異。相同時間下，A2誘導率最高，A3次之，A4最低，因此培養(yǎng)時間小于30 d時，三種激素配比對叢生芽誘導能力為A2＞A3＞A4。誘導時間為30～60 d時，A2叢生芽誘導率呈下降趨勢，芽體逐漸由嫩綠色變?yōu)辄S綠色，個別出現畸形，在培養(yǎng)60 d時大多數已變?yōu)榈S色或者白色。而A4叢生芽誘導率仍呈上升趨勢，葉片愈傷組織誘導出的叢生芽顏色一直為綠色的球莖，因此當培養(yǎng)時間大于40 d時，三種激素配比對叢生芽誘導的能力為A4＞A3＞A2。

圖1 不同誘導時間對叢生芽影響變化曲線

2.4 不同激素配比對長壽花不定根誘導的影響

由表7可知，不同激素濃度配比對長壽花不定根的誘導率不同。當1/2MS培養(yǎng)基中加入0.3 mg/L的IBA時，長壽花不定根誘導的效果最佳，其中紅色重瓣長壽花的誘導率達到80.0%，黃色重瓣長壽花的誘導率達到73.3%。此培養(yǎng)基下誘導出的生根苗粗壯、長勢狀態(tài)好，根長為2～3 cm。NAA濃度相同時，IBA濃度越高，誘導率越高，因此高濃度的IBA有利于根的形成與分化。

表7 不同激素配比對長壽花不定根的誘導

2.5 長壽花葉片不同誘導時期發(fā)育動態(tài)變化

葉片培養(yǎng)7～14 d后，紅花葉片切口處形成白色或淡黃色愈傷組織（圖2A），21 d后由淡黃色轉變?yōu)辄S綠色，部分葉片邊緣為紅色（圖2B）。7～14 d黃花葉片切口處形成白色愈傷組織（圖2C），21 d后由白色轉變?yōu)辄S綠色，部分為黃白色（圖2D）。將已經初步誘導35 d的愈傷組織進行不定芽的誘導分化，接種誘導7 d后，愈傷組織增殖加快并明顯由淡黃色轉變?yōu)辄S綠色，部分出現芽點(圖2E)，14 d后愈傷組織轉變?yōu)榫G色，芽點陸續(xù)分化為綠色小芽（圖2F），35 d后形成叢生芽（圖2G）。待不定芽生長至2～3 cm時，將健壯的單株芽苗切下轉接至生根培養(yǎng)基中，14 d后形成不定根（圖2H），25 d后生長為健壯的無性苗（圖2I）。

圖2 長壽花葉片不同誘導時期發(fā)育動態(tài)變化

3 討論

我國是盆栽花卉生產和消費大國，但是多數中高檔花卉種苗從國外進口，其中長壽花多從丹麥引進［12］，我國自主育種技術和工廠化育苗體系亟待提高。通過葉片誘導愈傷組織的形成，可實現快速建立組培無性快繁技術體系，提高植物的繁殖系數［13］。在本研究過程中發(fā)現，不同花色組織培養(yǎng)快繁技術差異不大，且葉片切割成較小的材料，傷口周圍褐化程度較高。通過葉片誘導的愈傷組織為葉片原生質體培養(yǎng)、原生質體融合、遺傳轉化創(chuàng)造了良好的受體材料，為生物工程技術奠定了理論基礎［14］。

植物激素種類和配比對愈傷組織的誘導、不定芽的分化以及不定根的誘導起十分重要的作用。馬群等［15］研究發(fā)現2,4-D的濃度對誘導芽數的影響較大，當濃度為1.0 mg/L時，誘導的叢生芽芽數多、無失綠現象，而當濃度為1.5 mg/L時，芽數少、有部分失綠現象。本研究發(fā)現，高濃度的6-BA和高濃度的NAA更有利于長壽花愈傷組織的形成，6-BA較高時，誘導芽數較高。高濃度的6-BA和低濃度的IBA更有利于叢生芽的誘導，在6-BA 1.0 mg/L和IBA 0.1 mg/L激素配比下，長壽花叢生芽的增殖系數可達2.9，且叢生芽多，芽體肥大，長勢旺盛。激素配比為1/2MS+0.3 mg/L時對叢生芽形成不定根的誘導能力最佳，高濃度的IBA有利于不定根的形成與分化。

不同的培養(yǎng)時間對激素的誘導能力存在影響，誘導時間為0～30 d時，高濃度的6-BA和低濃度的IBA更有利于叢生芽的誘導。誘導時間為30～60 d時，在MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L培養(yǎng)基條件下叢生芽誘導率呈下降趨勢，芽體逐漸由嫩綠色變?yōu)辄S綠色，個別出現畸形，在培養(yǎng)60 d時大多數芽體已變?yōu)榈S色或者白色。而在MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L培養(yǎng)下叢生芽誘導率呈上升趨勢，葉片愈傷組織誘導出的叢生芽顏色一直為綠色的球莖，莖段愈傷組織誘導出的叢生芽為黃綠色且后期葉片不發(fā)黃，因此培養(yǎng)時間為40～60 d時，高濃度的6-BA和高濃度的IBA更有利于長壽花不定芽的誘導。

4 結論

本研究以成熟葉片為外植體，篩選出用1%的次氯酸鈉溶液消毒9～10 min滅菌處理最佳。最佳葉片誘導愈傷組織培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，最佳不定芽誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L。最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.3 mg/L。初步通過葉片誘導愈傷組織途徑建立長壽花組培快繁技術體系，為后續(xù)優(yōu)良品種快繁和工廠化育苗奠定基礎。