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    改良Hulth法結(jié)合戊二醛注射建立大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型

    2022-06-23 13:11:26管俊航
    臨床骨科雜志 2022年3期
    關(guān)鍵詞:戊二醛半月板造模

    饒 奇,管俊航,陳 東

    膝骨關(guān)節(jié)炎的主要特征是關(guān)節(jié)軟骨的軟化、變性、失去彈性并有進(jìn)行性剝脫碎裂,滑膜攝取變性軟骨碎片導(dǎo)致絨毛結(jié)節(jié)樣增生,鈣化軟骨碎片形成游離體,并伴隨關(guān)節(jié)韌帶和半月板的退變,引起關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙,嚴(yán)重影響行走功能和生活質(zhì)量。隨著社會(huì)的老齡化加劇,膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率不斷上升,需要深入研究新的治療方法來(lái)減緩疾病進(jìn)程[1]。但在未獲得循證醫(yī)學(xué)證實(shí)前,評(píng)估這些方法的有效性大多基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[2]。傳統(tǒng)Hulth法造模通過(guò)手術(shù)方法完全切斷膝關(guān)節(jié)的前交叉韌帶、后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶,完整切除內(nèi)側(cè)半月板,操作難度高,容易損傷關(guān)節(jié)軟骨面以及膝關(guān)節(jié)后血管和神經(jīng)等組織。改良Hulth法相較于傳統(tǒng)方法減少了后交叉韌帶的切除,既可以使關(guān)節(jié)穩(wěn)定性增加,又可以在降低操作難度的同時(shí)避免膝關(guān)節(jié)后方血管及神經(jīng)損傷。但無(wú)論是傳統(tǒng)造模還是改良造模方法,成功建立動(dòng)物模型均需要6周以上的時(shí)間。研究[3-5]認(rèn)為關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射化學(xué)試劑可以縮短造模時(shí)間。本研究采用改良Hulth法結(jié)合戊二醛注射建立大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型,試圖快速而有效地建立膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)特定病原體(SPF級(jí))SD大鼠32只,7~8周齡,體重200~250 g,雌雄不限,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于SPF級(jí)動(dòng)物房喂養(yǎng),控制溫度20~25 ℃,濕度 30%~60%,日夜周期12 h,自由飲食水,每周更換墊料。本研究于2020年8月~2020年11月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。

    1.2 器材與試劑BX53顯微鏡(Olympus),一次性清創(chuàng)包,大鼠固定臺(tái),1%戊巴比妥鈉(Merck公司),Masson三色染色液(上??茀R生物技術(shù)有限公司),4%戊二醛溶液(純度99%,北京長(zhǎng)江脈醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司),乙二胺四乙酸脫鈣液(純度99%,武漢卡諾斯科技有限公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1動(dòng)物模型的制備 將32只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組及對(duì)照組,每組16只。模型組采用改良Hulth法結(jié)合戊二醛注射的方法進(jìn)行干預(yù)建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型;對(duì)照組不做任何干預(yù)。模型組建模具體步驟如下:① 1%戊巴比妥鈉1.0~1.5 ml(40 mg/kg)腹腔注射,待夾趾反射消失后,將大鼠俯臥位于固定臺(tái)固定,用1%活力碘消毒右側(cè)下肢2次,鋪無(wú)菌巾。② 在右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)剪開皮膚及筋膜,止血鉗鈍性分離膝部肌肉,找到內(nèi)側(cè)副韌帶。在內(nèi)側(cè)副韌帶與髕韌帶之間用手術(shù)刀縱向劃開暴露膝關(guān)節(jié),切斷副韌帶,外展膝關(guān)節(jié),找到內(nèi)側(cè)半月板,在內(nèi)側(cè)半月板前后分離內(nèi)側(cè)半月板,止血鉗鉗夾半月板中部提起,手術(shù)刀尖緩慢分離半月板直至完整夾出。③ 直視下切斷前交叉韌帶。④ 恢復(fù)膝關(guān)節(jié)正常位置,縫合肌肉,取4%戊二醛0.5μl注射于關(guān)節(jié)腔,逐步縫合關(guān)節(jié)囊、肌肉筋膜和皮膚,切口處1%活力碘消毒后放回籠飼養(yǎng)。見圖1。

    圖1 模型組制備膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的步驟 A.找到并暴露右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶(箭頭所示);B.切斷內(nèi)側(cè)副韌帶(箭頭所示);C.外展膝關(guān)節(jié)顯露內(nèi)側(cè)半月板(箭頭所示);D.完整切除半月板;E.找到前交叉韌帶并切斷(箭頭所示);F.縫合關(guān)節(jié)囊及肌肉層后關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%戊二醛0.5 μl

    1.3.2標(biāo)本的取材及處理 兩組處理方式相同。4周后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部麻醉后處死。剪開大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)處皮膚,暴露右側(cè)膝關(guān)節(jié),離斷膝關(guān)節(jié)遠(yuǎn)端與近端的脛骨和股骨,清理周圍肌肉和結(jié)締組織,只保留膝關(guān)節(jié)周圍組織,將組織放置于預(yù)先配置的甲醛液中固定24 h后,10%乙二胺四乙酸脫鈣液脫鈣1周。常規(guī)脫水包埋并脫蠟至水,Weigert鐵蘇木素(Weigert鐵蘇木素A、B液等比例混合液)染9 min,流水稍洗;1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,流水沖洗數(shù)分鐘;麗春紅酸性品紅液染9 min,流水稍沖洗;磷鉬酸水溶液處理約4 min,傾去玻片上磷鉬酸溶液(不用水洗)。用Masson染色試劑盒內(nèi)苯胺藍(lán)液復(fù)染4 min,傾去玻片上染液(不用水洗)。1%冰醋酸水溶液沖洗切片,至切片無(wú)藍(lán)色脫出;95%乙醇稍洗,無(wú)水乙醇水、二甲苯透明,中性樹膠封固。染色結(jié)果:膠原纖維、黏液、軟骨呈藍(lán)色;肌纖維、纖維素和紅細(xì)胞呈紅色;細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。

    1.4觀察指標(biāo)① 模型組術(shù)后連續(xù)觀察3 d,記錄體重、活動(dòng)及飲食變化。② 光學(xué)顯微鏡下觀察樣本的滑膜和軟骨的形態(tài)、數(shù)目、排列等情況。③ 對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行改良Mankin評(píng)分,Mankin評(píng)分是評(píng)估結(jié)構(gòu)(0~6分)、細(xì)胞異常(0~3分)、基質(zhì)染色(0~4分)和潮汐完整性(0~1分)的綜合評(píng)分,0分表示軟骨正常,而14分表示最嚴(yán)重的軟骨病變。由1名觀察者對(duì)兩組切片進(jìn)行鏡下Mankin評(píng)分,該觀察者對(duì)切片分組不知情。

    2 結(jié)果

    2.1 模型組術(shù)后一般情況模型組大鼠術(shù)后均蘇醒,術(shù)后3 d大鼠體重、食量、活動(dòng)情況見表1,提示手術(shù)未導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)死亡以及一般情況的明顯變化。術(shù)后1周手術(shù)切口均愈合良好,未發(fā)現(xiàn)感染跡象,大鼠活動(dòng)基本正常。

    表1 模型組大鼠術(shù)后一般情況(n=16)

    2.2 Masson染色組織學(xué)見圖2。對(duì)照組:第4周,關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整,厚薄一致,層次清晰;滑膜未見明顯炎癥細(xì)胞,未見毛細(xì)血管增生、充血,以脂肪組織為主。模型組:第4周,模型組關(guān)節(jié)軟骨表面明顯粗糙、凹凸不平整,關(guān)節(jié)軟骨層厚薄不一致,部分軟骨剝脫、碎裂,細(xì)胞明顯增多;滑膜組織有中性粒細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),毛細(xì)血管增多并充血,膠原纖維增多,部分增粗伴玻璃樣變性。

    圖2 兩組大鼠第4周膝關(guān)節(jié)軟骨及滑膜Masson染色結(jié)果觀察(×100) A. 對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整,厚薄一致,層次清晰(左圖箭頭所示),滑膜未見明顯炎癥細(xì)胞,未見毛細(xì)血管增生、充血,以脂肪組織為主(右圖箭頭所示);B. 模型組關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生了軟骨細(xì)胞數(shù)目增多、軟骨表面凹凸不平以及軟骨層發(fā)生斷裂的變化(左圖箭頭所示),滑膜組織由原來(lái)大部分脂肪變成了少量脂肪、大量增生的毛細(xì)血管、中性粒及單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維增多(右圖箭頭所示)

    2.3 改良Mankin評(píng)分第4周大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織改良Mankin評(píng)分:對(duì)照組為0~4(2.13±0.99)分,模型組為5~9(6.63±0.91)分,模型組明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    3 討論

    目前,晚期膝骨關(guān)節(jié)炎多采用膝關(guān)節(jié)置換術(shù)治療,效果顯著[6];早中期膝骨關(guān)節(jié)炎則主要采用非手術(shù)治療[7]。近年來(lái),一些新興的非手術(shù)治療方法逐漸增多[8],然而對(duì)這些新興的療法無(wú)法進(jìn)行廣泛、多中心的論證,只能通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行研究。所以建立早中期的骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型對(duì)新興療法的評(píng)估是非常重要的。骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型按動(dòng)物類型可分為小型、大中型以及靈長(zhǎng)類[9-10]。其中小型動(dòng)物模型較為常用,這主要是因?yàn)樾⌒蛣?dòng)物不但具有容易獲取、飼養(yǎng)方便、生存能力強(qiáng)、易于操作等優(yōu)點(diǎn),而且還可適用很多造模方法,包括制動(dòng)、喂養(yǎng)、關(guān)節(jié)內(nèi)注射化學(xué)物質(zhì)、手術(shù)等[11-13]。

    本研究采用改良Hulth法手術(shù)切除膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定裝置結(jié)合戊二醛膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射,4周后成功建立了具有典型病理學(xué)特征的大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型,Masson染色結(jié)果及Mankin評(píng)分顯示,模型組膝關(guān)節(jié)呈早中期骨關(guān)節(jié)炎病理改變。湯曉晨 等[14]采用傳統(tǒng)Hulth法將兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶、部分內(nèi)側(cè)半月板切除造模,造模成功后組織病理切片結(jié)果顯示,關(guān)節(jié)軟骨層變薄,關(guān)節(jié)軟骨裂隙缺損達(dá)中層,結(jié)構(gòu)破壞較嚴(yán)重,軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少,為晚期骨關(guān)節(jié)炎病理表現(xiàn)。本研究結(jié)果與之部分相似,不同之處是本研究顯示軟骨細(xì)胞數(shù)量增多,關(guān)節(jié)軟骨病變程度較輕。對(duì)比結(jié)果,我們從臨床分期治療的角度來(lái)看,本研究模型更適合進(jìn)行非手術(shù)治療的干預(yù)。造成這種不同程度的病理改變的原因可能是改良Hulth法減少了后交叉韌帶的切除,增加了膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性,進(jìn)而減輕了關(guān)節(jié)不穩(wěn)所致軟骨細(xì)胞的壞死及凋亡。此外,還可能與關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射戊二醛導(dǎo)致胞膜氧化、膜蛋白變性引起細(xì)胞壞死凋亡后的反應(yīng)性增生相關(guān)。王云峰 等(2009年)采用改良Hulth法對(duì)兔進(jìn)行膝骨關(guān)節(jié)炎造模,造模6周后組織病理切片結(jié)果顯示軟骨組織學(xué)表現(xiàn)為中度軟骨損傷,HE染色結(jié)果顯示軟骨表面裂隙可達(dá)放射層或鈣化層,軟骨細(xì)胞克隆增多,軟骨細(xì)胞簇集,潮線完整,為中期骨關(guān)節(jié)炎病理表現(xiàn)。本研究結(jié)果與之基本相似,不同之處是本研究模型組較單一改良Hulth法縮短了2周造模時(shí)間。

    已有研究[15-16]表明,通過(guò)手術(shù)造模方法所帶來(lái)的手術(shù)創(chuàng)傷會(huì)使關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥因子升高,特別是腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6等。炎癥因子的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡增加,細(xì)胞外基質(zhì)降解,最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射戊二醛可能影響了炎癥因子濃度,也可能使炎癥因子的活性降低,因此會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生一定影響。此外,受實(shí)驗(yàn)條件的限制沒有在實(shí)驗(yàn)前后進(jìn)行血清炎癥因子檢測(cè)是本實(shí)驗(yàn)的不足之處,在今后的實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步完善并驗(yàn)證。

    綜上所述,改良Hulth法結(jié)合戊二醛注射能快速而有效地建立大鼠早中期膝骨關(guān)節(jié)炎模型,造模成功時(shí)間較單一改良Hulth法提前了2周,動(dòng)物死亡率低且造模成功率高,組織切片符合膝骨關(guān)節(jié)炎的病理表現(xiàn)。該造模方法是對(duì)原有動(dòng)物模型研究的改進(jìn),操作方法規(guī)范可重復(fù)性強(qiáng),經(jīng)指導(dǎo)培訓(xùn)后即可掌握且易于推廣;在保證模型質(zhì)量的情況下,通過(guò)手術(shù)操作改進(jìn)與化學(xué)試劑干預(yù)相結(jié)合的方法優(yōu)化動(dòng)物模型的建立,有利于實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究的成果轉(zhuǎn)化。

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