基于4-PHF（the four-parameter Hill function)法比較6 種四照花種子的休眠特性

熊 星，魯 強，王昊偉，楊 玲，洑香香

（南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心/南京林業(yè)大學林學院，江蘇 南京 210037）

0 引言

【研究意義】四照花屬（Cornus）為山茱萸科落葉小喬木或灌木，樹種樹姿秀麗，夏賞玉花，秋觀紅果、紅葉，集觀葉、觀花、觀果于一身，是具有開發(fā)應用前景的園藝觀賞樹種[1]。四照花包括東亞四照花和北美四照花兩大類群[2]，《中國植物志》[3]把兩者分開并獨立成屬，分別命名為東亞四照花屬（Dendrobenthamia）和北美四照花屬（Cynoxylon）。東亞四照花類群包括10 個種，除日本四照花（亞種中國四照花）和多脈四照花外，其他均為常綠種，分布于喜馬拉雅至東亞各地區(qū)，我國全有（包括1 種引種栽培的在內），根據Xiang 等[4]的分類系統(tǒng)，東亞四照花類群（Cornus）則被分為5 個種。北美四照花類共有3 個種，均為落葉種，主要分布于加拿大、美國和墨西哥[5]，四照花的自然種群的遺傳特征受到其花粉和種子的傳播方式影響[6]，北美目前已有超過100 個栽培品種，我國現(xiàn)對其引種、推廣栽培也進行相關研究[7-8]。中國作為東亞四照花野生種質資源主要分布的地區(qū)，其園藝觀賞價值也逐漸受到關注[9]。在種子發(fā)芽指標中，發(fā)芽率是決定一個種批適合商業(yè)使用的重要參數，其他發(fā)芽參數也有著重要作用，比如發(fā)芽速率影響苗圃出苗的均勻性[10]。當發(fā)芽過程符合數學函數時，該函數的參數可用來更好地理解種子的發(fā)芽進程和種子預處理對發(fā)芽的促進作用。許多曲線擬合函數已經被使用，并對其描述種子發(fā)芽過程的適宜性進行了嚴格的評估[11-13]。采用4-PHF（four-parameter Hill function）對種子萌發(fā)進程進行曲線擬合，并對其參數進行生物學解釋，可加強對基因型，種批和種子預處理間對發(fā)芽差異的理解?！厩叭搜芯窟M展】四照花屬種子存在深度休眠，播種后需2年才萌發(fā)[14]。根據Baskin的分類方法[15]，四照花種子的休眠類型為生理休眠；用500 mg·L-1赤霉素（GA3）溶液浸泡種子結合低溫層積，可有效解除種子休眠，促進種子萌發(fā)[16-17]。因四照花屬各樹種的分布范圍較廣，不同種的休眠程度存在顯著差異[18]。El-Kassaby等[19]提出4-PHF 曲線擬合模型，并將休眠指數（DI）定義為打破種子休眠處理的發(fā)芽率的提高，其大小由種子處理前后萌發(fā)曲線之間的面積來確定，以此定量估計種子的休眠程度或是種子預處理對解除休眠的效果。具體方法如下：函數通過變形后可獲得到種子萌發(fā)瞬間速度以及達到最大萌發(fā)率的時間，然后通過Richter 和Switzer 積分法[20]對發(fā)芽率最高的曲線和未經層積處理的發(fā)芽曲線進行積分，求得2 個發(fā)芽曲線之間的面積，即休眠指數?！颈狙芯壳腥朦c】對四照花類群種子萌發(fā)進程進行曲線擬合的相關研究有待深入進行?！緮M解決的關鍵問題】對東亞四照花類群中的中國四照花（C.kousasubsp.chinensis）、秀麗四照花（C.hongdongensissubsp.elegans）、東京四照花（C.hongdongensissubsp.tonkinensis）、香港四照花（C.hongkongensis）、尖葉四照花（C.elliptica），和北美四照花類群中的大花四照花（C.florida）種子DI 值進行估算，并通過積分法定量比較不同種四照花種子休眠程度及預處理對解除休眠的效果，從而探討不同種四照花種子萌發(fā)差異。研究結果可為四照花種質資源保存、種子貯藏及開發(fā)利用等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6 種四照花種子均為當年采收后進行發(fā)芽試驗，采收后搓去果肉，淘洗干凈后晾干，于0～4 ℃下保存。種子采集信息如表1。

表1 6 種四照花種子采集信息Table 1 Information on seed collection

1.2 試驗方法

1.2.1 種子預處理 浸泡處理：采用500 mg·L-1赤霉素（GA3）溶液浸泡種子3 d，每天更換溶液。

層積處理：將浸泡處理后的種子進行低溫層積。種沙體積比為1∶3，濕度控制在手握成團、松手即散的狀態(tài)，混合均勻后裝入打孔的自封袋中，在0～5 ℃的黑暗條件下進行低溫層積。設7 個層積時間梯度：0、10、20、30、40、50 和60 d；層積過程中每周攪拌1 次，以保證良好的通氣狀況；層積期間采用500 mg·L-1GA3溶液保持適宜濕度。

1.2.2 發(fā)芽試驗 將層積后的種子與濕沙混合置于人工氣候室進行發(fā)芽試驗。發(fā)芽測定采用4 個重復，每個重復100 粒種子。發(fā)芽溫度為25 ℃，每天光照8 h。發(fā)芽期間，每天統(tǒng)計發(fā)芽種子數量。發(fā)芽標準參照《林木種子檢驗規(guī)程》（GB 2772—1999）[21]的規(guī)定，發(fā)芽持續(xù)時間為1 個月，以胚根突破種皮且長度達種子一半為標準統(tǒng)計發(fā)芽率。

發(fā)芽指標為絕對發(fā)芽率：正常發(fā)芽的種子總數占供測定的飽滿種子總粒數的百分率。

1.3 數據統(tǒng)計分析

1.3.1 四參數希爾方程（4-PHF）利用MATLAB（The MathWorks,Inc.2017），根據4-PHF（1）對種子的累積發(fā)芽率進行擬合。其中x和y變量分別為萌發(fā)時間（d）和在第x天的累積萌發(fā)率（%）。

a—漸近線，即最大累積發(fā)芽率，等于發(fā)芽能力；

b—控制萌發(fā)曲線形狀和斜率的數學參數（b越大，斜率越趨向于漸近線a，而從初始發(fā)芽至最大發(fā)芽經歷的時間越短）；

c—為50%的活力種子發(fā)芽所需的時間；

y0—y軸截距，用于計算初始發(fā)芽時間（lag）。

1.3.2 發(fā)芽參數的計算

1）起始萌發(fā)時間（lag）：設y=0，求解方程（1）獲得方程（2），計算萌發(fā)起始時間：

2）種子日萌發(fā)率（S）：對方程（1）求一階導數可得瞬時發(fā)芽率曲線方程（3），估計出種子日萌發(fā)率，也可以檢測萌發(fā)速度對其中的任何變量的敏感程度。公式如下：

3）發(fā)芽高峰日（TMGR）：將方程（2）繪制成以時間為變量的曲線（4），TMGR 是發(fā)芽曲線上達最大時所對應的時間。

4）休眠指數（DI）：對得到發(fā)芽率最高的曲線和對照處理的發(fā)芽曲線進行積分（5），求得兩個發(fā)芽曲線之間的面積即DI 值，由下式計算出：

y1、y2分別為休眠解除處理前后同一種批的累積發(fā)芽曲線，t0、tn分別為萌發(fā)開始和結束時的天數。

2 結果與分析

2.1 層積時間對各種四照花種子休眠解除的影響

種子的絕對發(fā)芽率是對種子休眠研究的重要參照指標，可以較直觀地衡量解除種子休眠的程度。由圖1 可以看出，層積時間對不同四照花種子休眠解除的效果存在顯著差異（P＜0.05）。

圖1 層積時間對各種四照花種子絕對發(fā)芽率的影響Fig. 1 Effect of stratification duration on absolute seed germination percentage of various dogwoods

大花四照花（CF）、中國四照花（CKC）、香港四照花（CH）、尖葉四照花（CE）、東京四照花（CHT）和秀麗四照花（CHE）的最高發(fā)芽率分別為89%、78%、71%、54%、69%和63%；值得注意的是，6 種四照花達到最大發(fā)芽率所需的層積時間差異很大，分別為60、30、60、50、50 和50 d。造成這種差異的原因一方面可能因種子本身活力差異，如前二者沒發(fā)芽的種子大部分為腐爛粒；另一方面層積處理未能完全打破種子休眠，如后四者未發(fā)芽的種子大部分為新鮮粒。

相比較而言，短時間層積處理對落葉類的大花四照花和中國四照花種子解除休眠效果更為顯著，二者層積30 d 時的發(fā)芽率分別達78%和75%，已基本解除了種子休眠；而其他4 種常綠類四照花則在層積50～60 d 時才達到最大發(fā)芽率，且并沒完全解除休眠。由此推測，常綠類四照花種子的休眠程度明顯深于落葉四照花種子。

2.2 種子累積發(fā)芽率曲線擬合

利用MATLAB 中的曲線擬合程序，以4-PHF（1）為模型進行擬合。擬合參數見表2（P＜0.05）；擬合曲線見圖2。

表2 不同層積時間下6 種四照花種子休眠解除的四參數希爾方程（4-PHF）的擬合參數Table 2 4-PHF fitting parameters for dormancy release of dogwood seeds after stratification

從擬合的結果看，發(fā)芽率較高的種子，其a值也大；隨著層積時間的延長，a值逐漸增大，表明在適合的層積天數范圍，層積時間越久，種子發(fā)芽能力越強。隨層積時間的增加，b值有逐漸變小的趨勢。隨層積時間增加，c值逐漸減小，說明發(fā)芽速度加快了。綜上解釋表明該函數可用于擬合種子發(fā)芽進程，利用該函數的參數可更好地理解種子的發(fā)芽行為。

圖2 整體擬合效果較好（R2均大于0.99）；除中國四照花種子隨著層積時間的延長（＞30 d）累積發(fā)芽率下降外，其他5 種四照花基本表現(xiàn)為隨層積時間的延長累積發(fā)芽率均呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，說明層積有效地促進了四照花種子休眠的解除。大花四照花種子層積30 d 后的累計發(fā)芽率與層積60 d 的結果相近（圖2-CF），而中國四照花層積30 d 已達到最大值（圖2-CKC）；其他四種四照花的情況也很好反映了層積時間對解除休眠的效應。

圖2 6 種四照花種子不同層積時間下累積發(fā)芽率的4-PHF 擬合曲線Fig. 2 4-PHF fitting curves for cumulative germination rates of dogwood seeds after stratification

2.3 6 種四照花種子萌發(fā)的參數比較

2.3.1 lag 與TMGR 將4-PHF 方程（1）的y設為0后，根據方程（2）計算萌發(fā)起始時間（lag）與實際的初始萌發(fā)時間進行比較（表3）。

由表3 可知，隨著層積時間的延長，各種起始萌發(fā)時間逐漸縮短。比較未層積處理各種的起始發(fā)芽時間，落葉類四照花（CF 和CKC）顯著短于常綠類四照花；常綠類四照花則表現(xiàn)為香港四照花及其亞種lag 更長。表明層積可以促使種子提前發(fā)芽，且一定時間范圍內，層積時間越久，則越快發(fā)芽；層積50 d 后，各四照花的lag 值僅為1～3 d?？傮w而言，計算得出的lag 的理論值要小于實測值2 d 左右，主要原因可能是實際統(tǒng)計發(fā)芽的標準是幼苗的基本結構出現(xiàn)時，到達這個階段所需時間要長于胚根突破種皮的發(fā)芽標準，由此看來，理論值和實測值基本相符。

表3 不同層積時間下6 種四照花種子的初始萌發(fā)時間（lag）的實際值與理論值Table 3 Actual and theoretical lag of dogwood seeds after stratification

根據方程（3），得到瞬時發(fā)芽率曲線（圖3）；根據方程（4），可以確定達到最大萌發(fā)率的時間，即TMGR。TMGR 表示萌發(fā)曲線上的斜率最大時對應的時間點；TMGR 值越小，說明種子預處理對縮短發(fā)芽進程產生的影響越明顯。

圖3 6 種四照花種子不同層積時間下的瞬時萌發(fā)率Fig. 3 Instant germination rate of dogwood seeds after stratification

對于大花四照花、中國四照花和秀麗四照花層積TMGR 出現(xiàn)最快均為層積60 d 的處理，分別為2、5.3 和3.3 d；東京四照花、香港四照花和尖葉四照花TMGR 出現(xiàn)最快的為層積50 d 的處理，3.4、7.5 和2.2 d。而最高瞬時發(fā)芽率和最快TMGR 相一致的處理出現(xiàn)在CF、CHE、CHT 和CE 上，其余兩種CKC 和CH 則有一定的差異。

2.3.2 休眠指數DI 對休眠解除前后的兩條4-PHF曲線進行積分，根據方程（4）計算其休眠指數（圖4）。

由圖4 可知，6 種四照花的DI 值由大到小的順序為：CF（16.50）＞CHE（13.6）＞CE（10.90）/CKC（10.79）/CH（10.62）/CHT（10.22）。

圖4 6 種四照花種子的休眠指數（DI）比較Fig. 4 DIs for seeds of 6 dogwood species

DI 值可以反映層積處理對解除休眠的效果。從數值上來看，層積60 d 基本解除了CF 的種子休眠，其他均存在不同程度的未完全解除休眠的效果，特別是常綠類四照花。DI 值適宜于評價同一樹種不同家系和不同種源間種子休眠程度的比較，而對不同樹種間評價效果不佳，本研究中的DI 值與發(fā)芽率存在一定的差異支持了這個推論（圖1、4）。

3 結論與討論

本研究應用4-PHF 曲線擬合方程比較了層積處理時間對四照花屬下6 個種的萌發(fā)特性和休眠深度。研究發(fā)現(xiàn)6 種四照花種子都不同程度地受到層積處理的影響：均隨著層積時間的延長其發(fā)芽率呈穩(wěn)定的上升趨勢，但每個種到達最大值的時間存在差異：CKC 僅需30 d，而CF 和CH 則需60 d，其他種則需50 d；同時伴隨著其他發(fā)芽參數lag（表3）和TMGR（圖3）值的穩(wěn)定下降。通過休眠解除前后積分面積計算獲得的休眠指數DI，也隨著層積時間的延長也呈增加的趨勢（圖2），說明層積處理有效地促進了種子休眠解除和種子萌發(fā)，類似結果也出現(xiàn)在小干松（Pinus contortavar.latifolia）和白云杉（Picea glauca）種子的萌發(fā)上[19]。比較6 種四照花的DI 值也發(fā)現(xiàn)，各個種達到最大值所需層積時間存在差異，說明其休眠程度各不相同。CKC 層積30 d就達到最大值，說明其種子的休眠程度較其他種子淺，但與Fu 等[22]的研究結果不一致，這可能與其種子來源不同有關。另外過長時間的層積并不利于CKC 種子的萌發(fā)，這種現(xiàn)象在白云杉、圓齒野鴉椿（Euscaphis konishii）和野鴉椿（Euscaphis japonica）種子上也有發(fā)現(xiàn)[19,23-24]。

種子休眠在植物中相當普遍，很多植物種子都具有不同程度的休眠，特別是溫帶和寒帶植物[15]。即使是同一樹種，因基因型和所處環(huán)境的差異，休眠深度在家系間和種源間也存在顯著差異[25]，如桃（Prunus persicaL.）[26]、樹莓（Rubus idaeusL.）[27]、香果樹（Emmenopterys henryiOliv.）[28]等。已有大量研究證明不同生境中種子休眠存在差異，如高溫、長日照、干旱環(huán)境下以及低緯度地區(qū)植物種子具有較低程度休眠[29]。此外，種子休眠程度與植物自身特征（種子大小、種皮厚度和開花時間等）有關，小種子比大種子一般具有更深程度的休眠，種皮厚

度增加會加深休眠程度[30]。前期研究表明，四照花類植物種子存在一定程度的生理休眠，采用500 mg·L-1GA3溶液浸泡種子3 d 后進行低溫層積30～60 d 即可打破休眠[22]。由于6 種四照花的適生區(qū)域各不相同，而有的樹種的分布范圍很大，從而產生了不同的休眠特性以適應相應的環(huán)境。

利用4-PHF（four-parameter Hill function）描述種子累計發(fā)芽進程，該函數的4 個參數可以對發(fā)芽進程和種子預處理對促進發(fā)芽的影響進行直接或間接生物學解釋。種子發(fā)芽參數受種子本身遺傳特性和外界環(huán)境的影響具有多樣性，發(fā)芽參數有助于估計種子到幼苗的轉化率，從而評估該種子是否適合商業(yè)化育苗，發(fā)芽參數也有助于評價種子預處理（尤其是解除休眠）和苗圃經營措施的效果[31]。本研究中所得的發(fā)芽參數是用4-PHF 擬合曲線的產物，此曲線擬合方法也被用于評價種子預處理和比較種批間的差異[32]，El-Kassaby 等[19]就應用4-PHF 來評價小干松和白云杉種子的萌發(fā)特性，并從生物學角度詮釋了基因型、種批和預處理間的萌發(fā)差異。本文用此方法比較不同預處理對四照花屬下各種間種子的萌發(fā)差異，發(fā)現(xiàn)采用此方程所計算的各萌發(fā)參數lag 和TMGR 值比僅用發(fā)芽率更合理地反映種子的發(fā)芽能力；而DI 值反映了層積處理對解除休眠的效果，但種間休眠程度的比較效果不佳。在運用DI 值反映休眠程度時，因為不同種植物打破休眠的處理有差異，發(fā)芽曲線需對沒有預處理的發(fā)芽曲線（對照組）與完全打破其休眠的發(fā)芽曲線進行積分，而統(tǒng)一處理進行比較效果不明顯?？傮w來看，本研究結果對四照花種苗生產具有科學的指導意義，對其他種子萌發(fā)進行數學表示和發(fā)芽參數提取具有借鑒意義。