滇黃芩總黃酮不同極性萃取部位對非酒精性脂肪肝模型大鼠的改善作用研究

王蒙蒙 喬雪 方瓊蓮 付勝男 李欣坪 黃豐 林玉萍

關(guān)鍵詞滇黃芩;總黃酮;極性萃取部位;非酒精性脂肪肝;保肝;氧化應(yīng)激;炎癥因子

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種常見的慢性肝病，在發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高，是隱源性肝硬化和慢性肝病的主要病因之一[1 - 2]。NAFLD的全球患病率約為25%，如果不進(jìn)行及時(shí)治療，可能發(fā)展為肝硬化以及肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌，甚至導(dǎo)致死亡[3]。與NAFLD發(fā)展密切相關(guān)的危險(xiǎn)因素包括胰島素抵抗、脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡和纖維化等，調(diào)節(jié)脂代謝紊亂、減輕氧化應(yīng)激和炎癥是中藥治療NAFLD的關(guān)鍵[4]。

滇黃芩為唇形科植物滇黃芩Scutellaria amoena C.H. Wright 的根，又名枯芩、西南黃芩等，主要分布在云南、四川、貴州等地[5-6]。《云南民族藥大辭典》記載，其味苦、性寒，歸肝、肺、胃、膽、大腸經(jīng)，彝醫(yī)常用于治療肝痛、傳染性肝炎、肺咳等疾病[7]。關(guān)于滇黃芩藥理活性的研究報(bào)道較少，目前的研究報(bào)道僅顯示其具有抗氧化[8-9]、抗心律失常[10]、改善四氯化碳（CCl4）所致肝損傷等作用[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，滇黃芩主要以黃酮類成分為主，具有較好的降脂作用[12-13]。本研究擬以高脂飲食誘導(dǎo)建立NAFLD大鼠模型，考察滇黃芩總黃酮不同極性萃取部位對模型大鼠的保肝作用，探究滇黃芩在抗氧化、保肝等方面的藥用價(jià)值，為民族藥滇黃芩資源的充分利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Infinite M200 PRO 型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司），H1850R型臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），RM2016 型組織切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司），XB220A 型電子分析天平（瑞士Precisa 公司），NikonECLIPSE C1 型正置顯微鏡、Nikon Digital Sight DS-FI2型成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）。

1.2 主要藥品與試劑

滇黃芩藥材于2017 年采自云南省新平縣，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院普春霞副教授鑒定為唇形科植物滇黃芩S. amoena C. H. Wright 的根?？偰懝檀迹╰otalcholesterol，TC）測定試劑盒（批號20191102）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）測定試劑盒（批號20191203）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測定試劑盒（批號20191130）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）測定試劑盒（批號20191129）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒（批號20191202）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒（批號20191129）均購自南京建成生物工程研究所;丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（ 批號120718190301）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號032219190408）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒（批號112618190311）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測試劑盒（批號20032602R）、IL-6 檢測試劑盒（批號20032603R）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒（批號20032607R）均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司;黃芩苷對照品（批號110715-201016，純度≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF 級SD大鼠，共36 只，雄性，6～8 周齡，體質(zhì)量180～200 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）-2016-0002]。購入后，將大鼠飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃、相對濕度（45±5）%、12 h 明暗交替的環(huán)境中，喂養(yǎng)期間予其自由攝食和飲水。本實(shí)驗(yàn)通過了云南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的倫理審核（動物倫理學(xué)審查編號為R-06201945）。

2 方法

2.1 滇黃芩總黃酮不同極性萃取部位的制備

取滇黃芩粉末2 kg，加入8 倍量（16 L）95%乙醇，加熱回流提取3 次、每次2.5 h，分別過濾并收集濾液。合并3 次濾液，減壓回收溶劑得到滇黃芩總黃酮提取物（記為SAF，得率為7.76%;經(jīng)高效液相色譜法測定，SAF中總黃酮含量為61.7 μg/mL，主要含黃芩苷、韌黃芩素Ⅱ -7-O-β-D- 吡喃葡萄糖醛酸甲酯、去甲漢黃芩素Ⅱ-7-O-β-D-吡喃糖醛酸甲酯、黃芩素、高車前素、漢黃芩素、白楊素和千層紙素A等成分）。取適量SAF，用水分散后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取3 次，回收溶劑后分別得到滇黃芩總黃酮乙酸乙酯、正丁醇萃取部位浸膏（分別記為SAFA、SAFB，得率分別為46.14%、17.26%）。將上述提取物的浸膏冷凍干燥成粉末，室溫保存，使用時(shí)用生理鹽水溶解。

2.2 造模、分組與給藥

將36 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)挑選6 只作為正常組，給予普通飼料;其余30 只大鼠為造模組，給予高脂飼料。所有大鼠均喂養(yǎng)12 周，然后將造模組大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、非諾貝特組（陽性對照）、SAF組、SAFA組和SAFB組，每組6 只。正常組、模型組大鼠給予生理鹽水（10 mL/kg）;非諾貝特組大鼠給予非諾貝特（20 mg/kg），劑量參考人體給藥劑量設(shè)置;SAF組、SAFA 組和SAFB 組大鼠分別給予相應(yīng)提取物300mg/kg（均以提取物的量計(jì)），劑量參考前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置。每日灌胃1 次，連續(xù)6周。

2.3 樣本取材及處理

末次灌胃后，大鼠禁食不禁水12 h，稱定其體質(zhì)量。腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，于腹主動脈取血;將血液于4 ℃靜置30 min 后，以3 000 r/min 低溫離心15 min，分離血清。同時(shí)，冰上取大鼠肝臟組織，觀察肝臟組織的一般外部形態(tài)（包括顏色、大小、厚度）。

2.4 肝臟指數(shù)測定

取“2.3”項(xiàng)下肝組織，以冰生理鹽水清洗干凈后，用濾紙吸干多余水分，稱量肝臟濕質(zhì)量，并計(jì)算肝臟指數(shù)：肝臟指數(shù)（%）=肝臟濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%[14]。

2.5 血清中TC、TG、AST、ALT、HDL-C、LDL-C 水平測定

取“2.3”項(xiàng)下血清，采用生化法檢測各組大鼠血清中TC、TG、AST、ALT、HDL-C、LDL-C 水平，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書方法進(jìn)行。

2.6 肝組織中SOD、GSH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平測定

取“2.3”項(xiàng)下肝組織，以生理鹽水制備10%組織勻漿，然后將勻漿在4 ℃下以3 500 r/min 離心15 min，吸取上層勻漿液。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測各組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書方法進(jìn)行。

2.7 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取“2.3”項(xiàng)下肝組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)制備石蠟切片（3 μm），行蘇木精-伊紅（HE）染色后，在顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時(shí)兩組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，方差不齊性時(shí)兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量、肝臟濕質(zhì)量和肝臟指數(shù)測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量、肝臟濕質(zhì)量和肝臟指數(shù)均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，僅SAFB組大鼠的體質(zhì)量顯著降低（P<0.05），但所有給藥組大鼠的肝臟濕質(zhì)量和肝臟指數(shù)均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠體質(zhì)量、肝臟濕質(zhì)量和肝臟指數(shù)測定結(jié)果見表1。

3.2 大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、ALT、AST水平均顯著升高（P<0.05），而HDL-C水平顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，除非諾貝特組大鼠血清中HDL-C水平和SAFA組大鼠血清中HDL-C、ALT水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P>0.05），其余各給藥組大鼠上述指標(biāo)均顯著改善（P<0.05）;與SAF 組、SAFA組比較，SAFB 組大鼠血清中TC、TG、AST 水平均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平測定結(jié)果見表2。

3.3 大鼠肝組織中MDA、GSH-Px、SOD水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中MDA水平顯著升高（P<0.05），而GSH-Px、SOD水平均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中MDA水平顯著降低（P<0.05），而GSH-Px、SOD 水平均顯著升高（P<0.05）;與SAF組和SAFA組比較，SAFB組大鼠肝組織中MDA水平顯著降低（P<0.05），SOD水平顯著升高（P<0.05）。各組大鼠肝組織中MDA、GSH-Px、SOD水平測定結(jié)果見表3。

3.4 大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著降低（P<0.05）;與SAF組比較，SAFA組大鼠肝組織中IL-1β水平顯著升高，SAFB組大鼠肝組織中IL-6、TNF-α水平均顯著降低（P<0.05）;與SAFA 組比較，SAFB 組大鼠肝組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平測定結(jié)果見表4。

3.5 大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

正常組大鼠肝細(xì)胞呈規(guī)則的放射狀排列，大小均勻，肝組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)均正常。模型組大鼠肝細(xì)胞周圍可見大量的脂肪空泡，多處細(xì)胞核萎縮壞死，有大量炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組比較，非諾貝特組大鼠肝細(xì)胞損傷狀況明顯改善，脂肪空泡明顯減少，細(xì)胞核大小正常，炎癥細(xì)胞浸潤明顯改善。滇黃芩總黃酮各極性萃取部位組大鼠肝損傷狀態(tài)均有不同程度改善，脂肪空泡和細(xì)胞壞死現(xiàn)象明顯減少，但仍有少量炎癥細(xì)胞浸潤;其中，以SAFB 組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化的改善更為明顯。各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察顯微圖見圖1。

4 討論

非諾貝特是臨床上常用于治療高脂血癥的藥物，也常作為陽性藥物在NAFLD相關(guān)研究中使用，故本研究選擇非諾貝特作為陽性對照藥物。血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST、ALT 水平是反映NAFLD 程度最常用的指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果顯示，以高脂飼料飼養(yǎng)12 周后，模型組大鼠的體質(zhì)量、肝臟指數(shù)均明顯升高，肝組織出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，且血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT 水平升高，血清中HDL-C 水平降低，提示建模成功。而非諾貝特組和滇黃芩總黃酮各極性萃取部位組大鼠肝臟指數(shù)均顯著降低，肝組織病理形態(tài)學(xué)變化得到一定程度改善，血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT 水平降低，血清中HDL-C 水平升高，并且SAFB 降低模型大鼠血清中TC、TG、AST水平和改善模型大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化的效果比SAF和SAFA更好。

人體內(nèi)氧化與抗氧化是一個(gè)動態(tài)平衡的過程，肝組織中的主要抗氧化酶系（包括SOD、GSH-Px 等）能夠抑制氧化損傷，是氧化應(yīng)激中重要的靶點(diǎn)[16]。MDA 是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，也是反映細(xì)胞氧化程度、病變進(jìn)程的重要指標(biāo)[17]。因此，SOD、GSH-Px 活性及MDA含量通常作為反映機(jī)體氧化損傷程度的指標(biāo)。在NAFLD期間，氧化應(yīng)激可能促進(jìn)肝臟脂質(zhì)堆積、浸潤性炎癥進(jìn)展及間質(zhì)纖維化進(jìn)展，因此，減輕活性氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、保持肝臟氧化還原穩(wěn)態(tài)，可能是防治NAFLD的有利策略[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中MDA水平升高，SOD、GSH-Px 水平降低;而非諾貝特組與滇黃芩總黃酮各極性萃取部位組大鼠肝組織中MDA水平降低，SOD、GSH-Px 水平升高;并且，SAFB 降低模型大鼠肝組織中MDA水平和升高SOD 水平的作用較SAF和SAFA更優(yōu)。

氧化應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是NAFLD發(fā)生的重要病理機(jī)制，當(dāng)氧化應(yīng)激水平升高后，會促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)肝損傷[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高;非諾貝特組與滇黃芩總黃酮各極性萃取部位給藥組大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平較模型組顯著降低，并且SAFB 組大鼠肝組織中IL-6、TNF-α水平較SAF 組和SAFA組降低得更為明顯。該結(jié)果表明，滇黃芩總黃酮可減輕NAFLD模型大鼠肝臟的炎癥反應(yīng)，從而緩解NAFLD的病理進(jìn)程，其中以SAFB的效果更好。

綜上所述，滇黃芩總黃酮各極性萃取部位均可通過調(diào)控氧化應(yīng)激、抑制炎癥因子的分泌發(fā)揮其對NAFLD的改善作用，且以正丁醇萃取部位的效果更好。