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    QuEChERS-GC-MS/MS法測定淡水魚中6種擬除蟲菊酯的殘留量

    2022-06-22 12:53:36楊金川白雪梅宋忠霞彭祖茂
    中國釀造 2022年4期
    關(guān)鍵詞:除蟲菊淡水魚菊酯

    楊金川,白雪梅,張 建,宋忠霞,彭祖茂

    (1.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院,貴州 貴陽 550001;2.貴州省廣告監(jiān)測中心,貴州 貴陽 550001)

    擬除蟲菊酯是一類高效廣譜、低毒、低殘留新型殺蟲劑,其殺蟲效率是有機氯、有機磷、氨基甲酸酯類的10~100倍,因此廣泛運用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)等生產(chǎn)中,但隨著在農(nóng)業(yè)、林業(yè)生產(chǎn)上的施用,其殘留物會在農(nóng)田排水、地表徑流、降水等進入水體后,并通過食物鏈最終進入人體,會給人類健康帶來嚴(yán)重隱患。有研究表明,當(dāng)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在人體內(nèi)長期積蓄時,會對人體的聽力系統(tǒng)[1]、神經(jīng)系統(tǒng)[2-3]、生育系統(tǒng)[4-5]等產(chǎn)生較大的危害。隨著對擬除蟲菊酯類殘留危害的關(guān)注,很多國家和地區(qū),逐漸加強了對一些水產(chǎn)品中擬除蟲菊酯類的限量,如國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission,CAC)規(guī)定了鮭肌肉中溴氰菊酯最高殘留限量為30 μg/kg;歐盟(European Union,EU)規(guī)定了水產(chǎn)品中氯氰菊酯和溴氰菊酯最高殘留量分別為50 μg/kg和10 μg/kg;美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)規(guī)定了魚類中溴氰菊酯最高殘留量為10 μg/kg[6];而我國在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》中也規(guī)定了魚肌肉中氯氰菊酯和溴氰菊酯最大殘留限量,為分別為50 μg/kg和30 μg/kg。隨著對一些水產(chǎn)品中擬除蟲菊酯類殘留危害的關(guān)注以及對氯氰菊酯和溴氰菊酯的限量,因此需要加強對擬除蟲菊酯類在魚類產(chǎn)品中的檢測研究。

    目前,對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留檢測技術(shù)很多,主要有酶聯(lián)免疫分析方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)[7-8]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[9]、氣相色譜法(gas chromatography,GC)[10-14]、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)[15-17]、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(liquidchromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[18-19]和氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)[20-21]。而前處理方法技術(shù)主要有固相萃取法(solid phase extraction,SPE),分散固相萃取法(dSPE)等。QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)技術(shù)是2003年ANASTASSIADES M等[22]首次提出,是在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型前處理凈化方法,其原理是通過吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用,吸附雜質(zhì)而達(dá)到除雜的目的,因其前處理簡單、快速,耗費有機試劑少,對環(huán)境友好等特點,經(jīng)多年發(fā)展,現(xiàn)已成動植物性食品中農(nóng)獸藥殘留的主要前處理技術(shù)之一。

    魚肉基質(zhì)復(fù)雜,其含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素以及礦物質(zhì)等,并且魚肉中有機基質(zhì)在前處理過程中較難去除干凈,所以會對菊酯類農(nóng)藥檢測帶來很大困難。本研究以貴州市售淡水魚(鯉魚、鱘魚、鰱魚)為研究對象,通過應(yīng)用QuEChERS前處理技術(shù),結(jié)合高靈敏度,高抗基質(zhì)干擾能力的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,對淡水魚中6種擬除蟲菊酯的定量進行研究,篩選出適宜的定性離子和定量離子,優(yōu)化方法條件,實現(xiàn)對6種擬除蟲菊酯類殘留的快速檢測,以期為魚肉中6種擬除蟲菊酯檢測提供技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    淡水魚:市售。

    氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氟氰菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L)、環(huán)氧七氯(內(nèi)標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L):農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所;N-丙基乙二胺(N-propyl ethylenediamine,PSA)(粒徑為40~63 μm)和十八烷基鍵合硅膠(C18,粒徑為40 μm):美國Agilent公司;乙酸乙酯(色譜純):默克公司;無水硫酸鎂(分析純):永大試劑有限公司;乙腈和氯化鈉(分析純):國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    TRACE 1300-TSQ 9000氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜、ThermoScientific TR-Pesticide Ⅱ色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm):美國Thermo Scientific公司;ME1002/02分析天平:梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品的制備

    淡水魚去鱗、去骨后,取肌肉組織勻漿處理,放入聚乙烯瓶中,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 樣品的前處理

    稱取勻漿處理的樣品5 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,先加2 mL超純水混勻,加入乙腈10 mL勻漿提取5 min,再加入2~3 g NaCl振蕩提取2 min,然后以5 000 r/min離心5 min,待取上清液,凈化;取4 mL上述上清液于15 mL聚丙烯QuEChERS凈化管(500 mg MgSO4+150 mg PSA+150 mg C18)中,渦旋振蕩1 min,6 000 r/min離心5 min,然后取2 mL離心上清液于玻璃試管中,45 ℃水浴中,氮吹吹至近干,用1 mL乙酸乙酯定容后,再加入20 μL 2.5 μg/mL的環(huán)氧七氯(內(nèi)標(biāo)),渦旋混合復(fù)溶,過0.22 μm濾膜到進樣小瓶中,待GC-MS/MS檢測。

    1.3.3 分析方法

    (1)氣相色譜檢測條件

    石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm):Thermo Scientific TR-Pesticide Ⅱ;載氣:氦氣(He),純度≥99.999%,流速1.00 mL/min;不分流進樣;進樣體積1 μL;進樣口溫度為250 ℃。程序升溫:初始溫度為40 ℃,保持1 min,以40 ℃/min 升至120 ℃,再以5 ℃/min升至240 ℃,最后以12 ℃/min 升至300 ℃,保持6 min。

    (2)質(zhì)譜檢測條件

    電子轟擊離子源(electron bombardment ion source,EI),溫度:280 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;碰撞氣:氬氣(99.999%);選擇反應(yīng)檢測掃描(selection response monitor,SRM)模式。

    上述條件下,各化合物的保留時間、定性及定量離子、碰撞能量等信息見表1。

    表1 6種擬除蟲菊酯的CAS號、保留時間、定性和定量離子以及碰撞能量Table 1 CAS No.,retention time,qualitative and quantitative ions,and collision energy of 6 pyrethroids

    續(xù)表

    1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)評價及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    本研究采用空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┡渲瞥上嗤瑵舛?,用以比較待測目標(biāo)物的峰面積,通過二者峰面積的相對比值評價基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME),如果ME>100%,說明存在基質(zhì)增強效應(yīng),ME值越大,基質(zhì)增強效應(yīng)越大;如果ME<100%,說明存在基質(zhì)抑制效應(yīng),ME值越小,基質(zhì)抑制效應(yīng)越強[23]。ME計算公式如下:

    式中:A表示純?nèi)軇┲心繕?biāo)物峰面積;B表示相同濃度下樣品基質(zhì)中目標(biāo)物峰面積。

    分別移取上述一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中,然后用乙酸乙酯稀釋定容,配制成各農(nóng)藥質(zhì)量濃度為2 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)儲備液,于-20 ℃保存,備用。試驗時,用對應(yīng)基質(zhì)空白溶液逐級稀釋,配成質(zhì)量濃度為5 μg/L、10 μg/L、30 μg/L、60 μg/L、150 μg/L、300 μg/L的一系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,并加入內(nèi)標(biāo),在1.3.3節(jié)分析條件下進行測定。以目標(biāo)物定量離子的峰面積(y)為縱坐標(biāo),進樣質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),進行線性回歸分析。

    1.3.5 加標(biāo)回收率試驗

    向空白樣品中(鯉魚、草魚、鳙魚)添加水平分別為3 μg/kg、30 μg/kg和300 μg/kg的擬除蟲菊酯,進行回收率和精密度實驗,每個添加水平5個重復(fù),計算回收率和精密度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 色譜條件選擇

    為了獲得最佳的SRM質(zhì)譜條件,在選定的氣相條件下,對各化合物先進行單級質(zhì)譜全掃描(50~500 m/z),分別獲得了其保留時間和具有代表性的母離子碎片,然后再采用產(chǎn)物離子掃描方式通過優(yōu)化碰撞能量及選擇的母離子碎片擊碎獲得產(chǎn)物離子,得到了1.3.3節(jié)中較為理想的質(zhì)譜檢測條件和SRM色譜圖,6種菊酯的GC-MS/MS色譜圖見圖1,其優(yōu)化后的峰型對稱較好,雖然聯(lián)苯菊酯和甲氰菊酯出峰時間較相近,但兩者對應(yīng)的母離子碎片及產(chǎn)物離子碎片都不同,檢測器會逐個離子分開掃描,所以對后期的定量定性均不會產(chǎn)生任何影響。

    圖1 6種擬除蟲菊酯的GC-MS/MS選擇離子流色譜圖Fig.1 Selective reaction monitoring of 6 pyrethroids by GC-MS/MS

    2.2 提取、凈化條件選擇

    2.2.1 提取試劑的優(yōu)化

    本研究先后考察了丙酮、乙酸乙酯和乙腈3種常用的農(nóng)殘?zhí)崛≡噭μ崛⌒Ч挠绊?,結(jié)果表明,丙酮提取的雜質(zhì)較多,不利于后續(xù)進行分離凈化處理;乙酸乙酯作為提取試劑由于無法浸入魚肉組織內(nèi)部,導(dǎo)致回收率不高;乙腈作為提取試劑,因其良好的共萃和分層特性,為后續(xù)的分離凈化提供方便,并且擁有良好的回收率。因此本研究選用乙腈作為提取試劑。

    2.2.2 凈化條件的選擇

    QuEChERS中常用到的吸附劑填料主要有石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)、PSA、C18和MgSO4[24-25],由于魚肉中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪及氨基酸等,所以混合使用PSA、C18和MgSO4,可以達(dá)到更好的凈化效果,但吸附劑用量會對回收率有一定的影響。所以本研究以在添加量為30 μg/kg鯉魚肉樣品為例,按1.3.2方法前處理提取,凈化時分別用考察的6種凈化組合凈化,再按1.3.3分析方法檢測,考察6種不同的凈化組和對各擬除蟲菊酯的回收率的影響,結(jié)果見圖2。

    圖2 鯉魚中6種擬除蟲菊酯在6種凈化劑中的回收率Fig.2 Recovery of 6 pyrethroids spiked in carp in six purifying agents

    由圖2可知,當(dāng)組合為Ⅰ和Ⅱ時,于PSA和C18吸附劑用量較少,雖然各擬蟲菊酯的回收率較高,但并通過總離子流圖(total ion chromatogram,TIC)對比發(fā)現(xiàn),雜質(zhì)去除效果較差;當(dāng)組合為Ⅲ~Ⅵ時,通過TIC圖對比發(fā)現(xiàn),均能達(dá)到很好的凈化效果,但當(dāng)隨著吸附劑用量的增加,聯(lián)苯菊酯的回收率降低明顯。最終,在綜合凈化效果、滿足各菊酯的回收率的同時降低實驗成本,最終選擇組合Ⅲ(PSA 150 mg+C18 150 mg+MgSO4500 mg)作為凈化吸附劑。

    2.3 基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

    以各質(zhì)量濃度為30 μg/L的標(biāo)液為例,分別配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)液,并采用1.3.4中基質(zhì)效應(yīng)的評價公式進行基質(zhì)效應(yīng)評價,按1.3.4節(jié)配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,用GC-MS/MS檢測并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性范圍、決定系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限結(jié)果見表3。

    表3 6種擬除蟲菊酯的線性范圍、決定系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限及定量限Table 3 Linear ranges,determination coefficients,matrix effect,LODs and LOQs of 6 pyrethroids

    由表3可知,6種擬除蟲菊酯在3種魚肉基質(zhì)中的ME在186%~335%之間,均存在較強的基質(zhì)增強。為了減小基質(zhì)效應(yīng)的影響[28],本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(內(nèi)標(biāo)法)進行定量。在線性范圍內(nèi),6種菊酯的峰面積與對應(yīng)的進樣質(zhì)量濃度間均呈良好的線性關(guān)系,決定系數(shù)R2均大于0.999 5。以被測化合物定量離子對3倍信噪比(S/N)確定的方法檢出限(limit of detection,LOD),10倍信噪比(S/N)確定的方法定量限(limit of quantitation,LOQ)分別在0.2~1 μg/kg和0.6~3 μg/kg之間。

    2.4 方法的精密度與加標(biāo)回收率

    當(dāng)空白樣品中添加水平分別為3 μg/kg、30 μg/kg和300 μg/kg,且每個添加水平5個平行時,測定加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations,RSD),結(jié)果見表4。結(jié)果表明,6種擬除蟲菊酯在魚肉中的平均回收率在83%~102%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%~4.9%之間。表明所建立方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和重復(fù)性。

    表4 6種擬除蟲菊酯在淡水魚中3個水平下的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 4 Recovery and RSD of 6 pyrethroids at three spiked levels in freshwater fish (n=5)

    續(xù)表

    2.5 實際淡水魚樣品中6種擬除蟲菊酯的測定

    從貴陽市各超市和農(nóng)貿(mào)市場隨機購買鱘魚、鰱魚、鯉魚等30份樣品,按照優(yōu)化的前處理方法和色譜條件進行檢測,結(jié)果均未檢出6種擬除蟲菊酯的殘留。

    3 結(jié)論

    本研究通過提取溶劑和吸附劑的篩選得以優(yōu)化QuEChERS前處理條件,并采取較優(yōu)的GC-MS/MS條件,建立了一種快速測定淡水魚(鯉魚、鱘魚、鰱魚)中6種擬除蟲菊酯殘留的分析方法。本研究對基質(zhì)效應(yīng)進行了考察,并通過配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線可以減少基質(zhì)效應(yīng)影響,從而實現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)的提取、凈化濃縮與多種菊酯類殘留的快速篩查及確證,能滿足淡水魚(鯉魚、鱘魚、鰱魚)中6種菊酯的快速定性和定量檢測,也可為其他淡水魚肉中6種擬除蟲菊酯檢測提供技術(shù)支持。

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