松香淀粉酯的酶催化制備及其對原花青素的負載研究

史永桂， 林日輝， 焦思宇， 林春燕， 陸曉娜， 楊麥秋

(廣西多糖材料與改性重點實驗室；廣西林產(chǎn)化學與工程重點實驗室；廣西民族大學化學化工學院，南寧 530006)

原花青素是一類具有多種生物活性的多酚化合物的總稱，其具有無毒、高生物的利用和抗氧化性特點，在人體內(nèi)有較強的體內(nèi)活性因子，因此被廣泛應用于藥品、食品、化妝品等領域[1]。Feldman 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，蔓越莓原花青素可以抑制白色念珠菌在體外培養(yǎng)的口腔上皮細胞上的活力，可以有效阻止口腔上皮細胞的炎癥發(fā)生。Yamakoshi[3]通過對大鼠口服葡萄籽的提取物原花青素進行急性毒劑量和慢性毒劑量實驗，結果表明兩種情況下均無毒副作用，為原花青素在體內(nèi)給藥提供了可靠的參考。Sato[4]對大鼠口服100 mg/d的原花青素，持續(xù)喂食3周后，發(fā)現(xiàn)大鼠的心臟在缺血-再灌注的收縮恢復功能提高，心肌梗死范圍明顯減少?？梢娫ㄇ嗨卦卺t(yī)藥的應用方面具有較高的潛在價值，但原花青素本身不穩(wěn)定性，藥效作用也極易受到劑量、體內(nèi)釋放速度以及體內(nèi)環(huán)境等因素影響，藥效不佳。郭寶慧等[5]研究了原花青素的抗氧化活性與劑量呈現(xiàn)效應關系，當原花青素超過一定的濃度時，抗氧化性將隨著濃度的升高而降低。閻娥等[6]發(fā)現(xiàn)蠶豆殼提取的原花青素，對羥自由基(OH)的清除能力隨濃度變化很大，結果表明當提取物的濃度高于0.01 mg/mL時，OH的清除率開始降低。Jacqueline[7]發(fā)現(xiàn)在不同的pH下，原花青素的抗氧化性有明顯的差別，在胃的酸性條件下原花青素聚合物容易分解。高冠勇等[8]對花生紅衣原花青素的穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)PC在光照條件下會發(fā)生氧化，失去抗氧化的性質(zhì)。為了充分發(fā)掘原花青素的藥用價值，需要開發(fā)新的制劑技術，包埋和負載緩釋成為了原花青素的研究方向，天然材料的生物相容性，使其成為藥物負載緩釋的研究熱點。

淀粉作為一種天然的高分子材料，在藥品、食品、化妝品和燃料生產(chǎn)方面有廣泛的應用[9，10]。Sai[11]用辛烯基琥珀酸酐對淀粉進行疏水改性并通過滲析包埋法制成OSA淀粉納米球，對蘆丁進行負載進行了體外釋放研究，結果表明改性后的OSA可有效將蘆丁負載并能良好的體外持續(xù)釋放。Zhu等[12]用可溶性淀粉和環(huán)氧氯丙烷合成環(huán)氧氯丙烷淀粉微球(ECM)，以精氨酸為模型藥物，研究了ECM的載藥量和體外釋放性能，結果表明ECM的載藥量可達31 mg/g，可在體外持續(xù)25 h釋放精氨酸。此外一些研究也表明改性淀粉對負載的藥物具有保護功能。劉占軍等[13]對淀粉接枝聚甲基丙烯酸甲酯并制備成納米粒，與蝦青素混合制備成蝦青素納米粒，研究了蝦青素納米粒在不同的溫度、pH、不同的光照條件下蝦青素的穩(wěn)定性，結果表明，在不同的條件下蝦青素的納米粒的保留率都有所提高，其中光照條件下的保留率相對丙酮溶液提高了58.1%。

松香基團具有強疏水性能，研究表明原木薯淀粉和松香在脂肪酶的催化下可酯化制備具有一定疏水性能的松香淀粉酯[14]。淀粉顆粒表面的羥基被部分取代，增加了淀粉表面的疏水性，提高了對疏水性物質(zhì)親和力。巫佳[15]通過RAS對苯酚和多環(huán)芳香烴苯并芘進行吸附研究，發(fā)現(xiàn)RAS 能夠較好地分散在水溶液中，能較好地吸附疏水性的多苯環(huán)結構物質(zhì)，是一種良好的生物降解材料的吸附劑。因此，采用松香酸對淀粉進行疏水改性，研究其在水溶液中的穩(wěn)定性和對水溶性差的藥物負載能力，為改性淀粉作為藥物載體提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原木薯淀粉，食品級；松香，AR級；原花青素，脂肪酶：BR。

1.2 儀器與設備

TG1650-WS 型臺式高速離心機；SUPRA 55 Sapphire 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡；A vance600MHz型核磁共振；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器。

1.3 方法

1.3.1 不同取代度RAS的制備

參考楊慧等[14]的方法制備RAS，并加以改進。稱量3 g烘干的原木薯淀粉和12 g松香于錐形瓶中，加入50mL的氯仿作為溶劑，在培養(yǎng)箱中震蕩5 min，使松香完全溶解。移取脂肪酶、水、乙醇各200 μL的加入反應混合物中，于55 ℃，180 r/min的震蕩培養(yǎng)箱中，反應若干小時。反應結束后，取出抽濾，收集濾餅，用無水乙醇清洗4次。產(chǎn)物放入60 ℃鼓風干燥箱過夜至恒重，即得松香淀粉酯。

1.3.2 酯化淀粉取代度測定

根據(jù)Lin[16]的方法適當改進，采用酸堿滴定法測定酯化淀粉的取代度。分別稱取2 g酯化淀粉和原木薯淀粉，放入150 mL的錐形瓶中并加入50 mL的0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，在磁力攪拌器上55 ℃皂化3 h。將皂化后的溶液冷卻至室溫，加入0.5 mol/L的鹽酸溶液8.5 mL攪拌均勻，滴加2～3滴酚酞作為指示劑再用0.025 mol/L的鹽酸進行滴定至終點。取代度計算公式為：

(1)

(2)

式中：W為松香基團的質(zhì)量分數(shù)；C為滴定鹽酸的標準濃度0.025 mol/L；V1為原木薯淀粉滴定消耗鹽酸的體積/L；V2為樣品淀粉滴定消耗鹽酸的體積/L；m為樣品的質(zhì)量/g；285為松香基團的平均相對分子質(zhì)量。DS為淀粉分子上每個葡萄糖單元上的羥基平均被取代的數(shù)量；162為淀粉分子上葡萄糖單元平均分子量。

酯化反應時間分別為3、6、9 h，代入公式計算得出取代度，得到制備的RAS的取代度分別為0.002 44、0.008 11、0.016 5。

1.3.3 原木薯淀粉和RAS掃描電鏡分析

取一定量的原木薯淀粉和不同取代度的RAS均勻的撒到雙面導電膠上，輕輕吹去多余的浮樣，置于真空鍍膜儀下噴鍍鈀金，制成電鏡觀察樣品，掃描電鏡下用500倍和5000倍拍照觀察。

1.3.4 原木薯淀粉和RAS的1H NMR分析

取少量干燥的原木薯淀粉和不同取代度的RAS，以DMSO-D6為溶劑，利用Avance 400 MHz核磁共振波譜儀檢測1H NMR波譜圖[17]。

1.3.5 原花青素標曲的制備

以水為溶劑，配置不同濃度梯度的原花青素溶液，用紫外分光光度計測量280 nm處吸光度。以原花青素濃度為橫坐標X(mg/mL)，吸光度為縱坐標Y。得到原花青素的標準曲線為Y=12.925X-0.007 3，相關系數(shù)為R2=0.999 5。

1.3.6 原木薯淀粉和不同RAS對PC的吸附

按照吳朝霞[18]吸附方法并做適當調(diào)整，稱取0.1 g的原木薯淀粉和酯化淀粉作為吸附劑放入2 mL的離心管中，加入1 mL的原花青素溶液，將離心管放在血液混凝器進行避光吸附操作，以不加淀粉的原花青素溶液作為對照。

將吸附反應完成后的混合液用高速離心機8 000 r/min離心5 min，移取上清液50 μL，加入10 mL的棕色比色管中，加入10 mL的蒸餾水稀釋200倍，搖勻在紫外分光光度計下測量吸光度，原花青素的吸附量計算見式(3)。

(3)

式中：q為吸附量/mg/g；C1為原花青素溶液質(zhì)量濃度/mg/mL；C2為吸附后的原花青素溶液質(zhì)量濃度/mg/mL；V為原花青素溶液體積/mL；200為稀釋倍數(shù)；m為用于吸附原花青素的樣品干質(zhì)量/g。

1.3.7 酯化淀粉吸附原花青素的單因素實驗

分別以原木薯淀粉和不同取代度RAS對PC吸附量為指標，考察在不同的吸附時間、濃度、溫度的影響。

1.3.7.1 不同的吸附濃度對吸附量的影響

稱取0.1 g的不同取代度的RAS和原木薯淀粉為吸附劑，放入2mL的離心管中，分別加入1 mL濃度為3、6、9 mg/mL的原花青素溶液，在室溫(25 ℃)下，于血液混凝器上避光吸附60 min，研究不同濃度對吸附量的影響。

1.3.7.2 不同的吸附時間對吸附量的影響

稱取0.1 g的不同取代度的RAS和原木薯淀粉為吸附劑，放入2 mL的離心管中，加入 1 mL濃度為9 mg/mL的原花青素溶液，于血液混凝器上在室溫(25 ℃)下避光進行吸附，吸附時間分別為15、30、45、60 min，研究吸附時間對吸附量的影響[18]。

1.3.7.3 不同吸附溫度對吸附量的影響

參考原花青素對溫度的穩(wěn)定性研究結果，原花青素在80 ℃下才會分解，因此溫度梯度不能過高。稱取0.1 g的不同取代度的RAS和原木薯淀粉為吸附劑，放入2 mL的離心管中，分別在25、40、50、60 ℃的震蕩培養(yǎng)箱中避光吸附，時間為60 min，研究吸附溫度對吸附量的影響。

1.4 穩(wěn)定性實驗

將吸附后的淀粉與PC的混合液放入血液混凝器上，室溫下避光靜置1、2、4、8 d，以PC溶液作為對照，測定記錄混合液和PC溶液的吸光值變化。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗如無特殊說明，均進行3次重復， Excel 2010對數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用Photoshop對圖片排版，利用Origin2018軟件進行繪圖和分析。

2 結果與分析

2.1 原木薯淀粉與RAS的電鏡圖

由圖1知在電鏡分析下原木薯淀粉顆粒保持圓形和橢圓形，不同取代度的RAS仍能保持與原木薯淀粉的顆粒形貌，表明酯化反應不會破壞原木薯淀粉的顆粒形狀，這與已有的結果相似。原木薯淀粉表面和邊緣光滑， RAS表面則較為粗糙，表明松香酸成功在原木薯淀粉表面發(fā)生了酯化，產(chǎn)生了酯化斑點[19]。淀粉顆粒較大，結晶度高，酯化反應只發(fā)生在淀粉的表面。隨著取代度的提高，可觀察到淀粉表面酯化斑點增多，斑點也較大?？赡艿脑蚴?，淀粉某一位點與松香酸發(fā)生反應后，該位點上的松香酸基團與溶液中的松香酸相親性增大，使得在淀粉表面的該位點局部連續(xù)產(chǎn)生酯化反應，形成酯化聚集顆粒。

圖1 RAS和原木薯淀粉電鏡圖

2.2 淀粉樣品的1H NMR分析

NMR通過不同的化學取代基團在NMR中的特征峰的不同來判斷物質(zhì)的結構。淀粉分子上的羥基在酯化反應中被取代，RAS上的葡萄糖單元質(zhì)子的共振會發(fā)生變化。由圖2可知與原木薯淀粉相比，RAS的1H NMR譜圖在1.125和1.225產(chǎn)生新的氫原子吸收峰，這是松香酸上的甲基和亞甲基上的氫質(zhì)子產(chǎn)生的吸收峰[20]，峰強度隨DS增大而增強，表明松香酸基團接枝在淀粉上隨DS增大而增多。

圖2 RAS和原木薯淀粉的1H NMR圖

2.3 不同吸附濃度對吸附量的影響

PC的初始濃度在RAS和原木薯淀粉對吸附有著重要影響。由表1可知，在25 ℃，吸附時間為60 min時，隨著PC的濃度增大，原木薯淀粉和RAS表面對PC分子的相互作用力增強，從而增加了吸附的量。RAS的疏水性，使得RAS顆粒在PC溶液中能更好地接觸吸附質(zhì)。但取代度為0.002 44的吸附量略低于原木薯淀粉，因酯化反應取代了淀粉上的羥基，使得淀粉顆粒和PC之間形成的氫鍵作用力減弱，減少了吸附量，表明該吸附是范德華力和分子間的氫鍵的共同作用的結果[21]。

表1 不同質(zhì)量濃度PC對吸附量的影響/mg/g

由表2可知，在25 ℃，吸附時間為60 min，當PC質(zhì)量濃度為9 mg/mL時，DS為0.00811的RAS相對原木薯淀粉的吸附量提高百分比最高。表明改性后的原木薯淀粉能有效提高對PC的吸附量，且隨PC濃度增加，RAS對PC的吸附能力相對原木薯淀粉也隨之提高。

表2 不同PC質(zhì)量濃度下RAS相對原木薯淀粉吸附量提高的百分比/%

2.4 不同吸附時間對吸附量的影響

由圖4可知，RAS和原木薯淀粉對PC的吸附速度較快，DS為0.008 11和DS為0.016 5的RAS 在30 min已基本達到吸附的飽和量，但原木薯淀粉和DS為0.002 44在45 min達到吸附飽和量，這與已有的研究結果相近。DS較高的RAS相對原木薯淀粉在短時間內(nèi)可達到飽和吸附量，可能與RAS在水中的顆粒分散性較好有關。在吸附時間45 min，原花青素質(zhì)量濃度為9 mg/mL，原木薯淀粉的飽和吸附量為20.19 mg/g，酯化取代度為0.002 44、0.008 11、0.016 5的淀粉，飽和吸附量分別為19.41、31.88、32.19 mg/g。

圖3 吸附時間對原花青素的吸附量影響

DS為0.0165的RAS在吸附時間為30 min時相對原木薯淀粉的吸附能力最高。RAS相對原木薯淀粉對PC的吸附速度隨時間先提高再降低，原木薯淀粉顆粒在水中易聚集形成顆粒聚集物，吸附劑的比表面積減小，吸附速率降低。表明吸附過程物理吸附占主導作用，吸附質(zhì)主要集中在淀粉顆粒表面，RAS在30 min內(nèi)RAS對PC的親和力較原木薯淀粉高，能更快對PC完成吸附。

表3 不同吸附時間下RAS相對原木薯淀粉吸附量提高的比例/%

2.5 不同溫度對原花青素的吸附量的影響

由圖2可知，原木薯淀粉和RAS對PC的吸附隨溫度的升高而增加，物理吸附主要與吸附質(zhì)分子與吸附劑相接觸完成吸附過程。溫度提高，使原花青素的分子運動速率增加，從而增加了PC與淀粉表面官能團接觸的幾率，增加了吸附量。在60 ℃時原木薯淀粉的吸附量是39.15 mg/g、酯化取代度為0.002 44、0.008 11、0.016 5的淀粉，吸附量分別為37.45、44.72、40.39 mg/g。這與在PC濃度為30 mg/g下，微孔淀粉的吸附量結果相近，表明RAS可在較低的PC濃度下，達到較高的吸附量。

圖4 吸附溫度對原花青素吸附量的影響

通過表4可知，隨著溫度的升高，RAS相對原木薯淀粉對PC的吸附速度降低，原木薯淀粉在溫度上升后，聚集的原木薯淀粉顆粒在溶劑中分散開來，使得原木薯淀粉的吸附能力增加，對PC的吸附速率增加。RAS由于疏水性，減少了淀粉顆粒之間的聚集，相同溫度下在水中的分散性較原木薯淀粉較好。

表4 不同吸附溫度下RAS相對原木薯淀粉吸附量提高的百分比/%

2.6 原花青素穩(wěn)定性實驗

原花青素在水溶液中不穩(wěn)定，易發(fā)生可逆反應，使顯色物質(zhì)的含量降低，即使是在室內(nèi)閉光的條件下仍會發(fā)生降解生成副產(chǎn)物，使PC溶液的顏色逐漸變淺，吸光值降低[22]。記錄吸光值的變化可以計算PC保留率。由圖5知，24 h內(nèi)淀粉吸附的溶液中PC的保存率在90%以上，高于PC溶液的保留率，表明經(jīng)過淀粉吸附后溶液具有一定的穩(wěn)定性，淀粉吸附后的溶液在24 h內(nèi)對PC具有較好的保存作用，為淀粉在負載藥物方面提供參考。

圖5 PC保留率隨時間的變化

3 結論

本實驗通過脂肪酶在兩相體系中催化合成了RAS，與原木薯淀粉相比， RAS表面的疏水性增加，提高了對疏水性藥物的親和力，有利于對疏水性藥物的負載。提高溫度和PC濃度，均可提高原木薯淀粉和RAS對PC的負載量； DS為0.008 11和0.016 5的RAS可明顯提高對PC的負載量且可較快達到吸附平衡，常溫下RAS最高負載量可達32.19 mg/g，相對原木薯淀粉最高可提高90.01%；淀粉吸附后的溶液在24 h內(nèi)對PC的保存率在90%以上，具有明顯的保持藥物的穩(wěn)定性。但RAS對PC的負載還有待研究，在藥物緩釋和模擬腸胃液穩(wěn)定性方面的實驗還有待展開。