7個品種草莓莖尖組培脫毒苗技術(shù)研究

沈 莉，曹玉梅

(互助縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)管委會，青海 互助 810599)

草莓作為一種深受消費者喜愛的鮮果，其營養(yǎng)價值高，富含維生素C，有幫助消化的功能。國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示，截至2019年我國草莓種植面積為1.25×105hm2，同比增長4.17%；草莓產(chǎn)量達3.28×106t，同比增長7.05%。其中山東、江蘇、遼寧三省在我國草莓產(chǎn)量中的占比近半，為48%，是我國草莓主產(chǎn)區(qū)[1]。

近年來互助縣草莓鮮果種植面積逐年增加，草莓鮮果平均公頃產(chǎn)量達16.5t，純收入75萬元/hm2以上，全縣草莓鮮果產(chǎn)量310t，產(chǎn)值900萬元以上[2]。但是，青?；ブ貐^(qū)種草莓種植年限較短，草莓作為一個新興產(chǎn)業(yè)還未形成完整產(chǎn)業(yè)鏈，種苗的來源與草莓病毒病制約著產(chǎn)業(yè)發(fā)展，在已報道的草莓病毒中，危害最為嚴重的病毒有草莓鑲脈病毒(SVBV)、草莓斑駁病毒(SMOV)、草莓皺縮病毒(SCV)、草莓輕型黃邊病毒(SMYEV)4種[3]。要想解決這個問題，自主培育草莓脫毒苗是最有效的途徑，前人提出草莓莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)是草莓脫除病毒的一種最經(jīng)濟有效的途徑[4]。本試驗為高寒地區(qū)利用莖尖組織培養(yǎng)培育草莓脫毒苗提供了參考依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

根據(jù)2018—2019年互助縣農(nóng)業(yè)示范園區(qū)引進草莓新品種在互助縣威遠鎮(zhèn)、塘川鎮(zhèn)、臺子鄉(xiāng)等地的試種結(jié)果，選擇其中生長性狀良好、鮮果口感佳的“白雪公主”、“章姬”、“紅顏”、“甜查理”、“通州公主”、“小白”和“京泉香”7個草莓品種。于2019年6月-7月采集匍匐莖用于莖尖組培。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料的采集

匍匐莖長出一周后即可采集，此時生長點明顯易辨別。選擇生長健壯無病蟲害侵染的草莓匍匐莖，用滅菌剪刀剪取前端3-5cm長的莖段，置于無菌瓶中，即刻帶回實驗室，用自來水持續(xù)沖淋30min以上。沖淋時瓶口包裹2層干凈紗布，用皮筋扎好瓶口，避免莖段溢出。

1.2.2 試驗材料的滅菌處理

將瓶裝75%酒精、3%次氯酸鈉溶液、3%雙氧水及瓶裝莖段用75%酒精噴霧消毒后放入超凈工作臺，進行莖段滅菌。滅菌順序及時間為：75%酒精，30s-3% NaClO，1.5min-3% H2O2，10s-滅菌純水清洗3至4遍。經(jīng)試驗證明污染率控制在2%以內(nèi)，實際操作過程中清洗時間長短可視莖段幼嫩程度適當(dāng)增減。

1.2.3 莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

將電子顯微鏡下剝出的大小約為0.1-0.5mm的莖尖全部接種到MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L GA3的試管裝培養(yǎng)基中，pH=5.8-6.0，每升培養(yǎng)基添加30g蔗糖和7g瓊脂，121℃滅菌30min；配方根據(jù)前人試驗結(jié)果適當(dāng)調(diào)整[5]，每管培養(yǎng)基接種1個，避免相互污染。置于溫度(25±2)℃，光照強度2000-3000 lx，光照時長12-16 h/d，濕度45%-50%的條件下培養(yǎng)，每個品種至少接種50個，接種30d后觀察各品種莖尖成活分化情況。

注：若操作不當(dāng)，試管一般在進入培養(yǎng)室后3-7d出現(xiàn)污染，要及時移出培養(yǎng)室并進行滅菌處理，減少污染源傳播。莖尖剝離過程中有可能會將葉原基誤當(dāng)做莖尖生長點，在接種一周左右即能觀察到葉片展開卻無其他組織分化，及時剔除即可。

1.2.4 芽叢繼代

莖尖生長約50-60d后，發(fā)育良好的會長出密集芽叢，待芽叢長至3-5cm進行繼代，在滅菌牛皮紙或培養(yǎng)皿上用解剖刀切開芽叢，接種到與莖尖誘導(dǎo)一樣的培養(yǎng)基中，3-5叢/瓶。置于適宜條件下(一般與莖尖培養(yǎng)條件一致)培養(yǎng)2個月左右，按需要生根或二次繼代。一般繼代次數(shù)不超過5次，否則幼苗生長弱化。

1.2.5 生根培養(yǎng)

對各品種組培苗按比例進行病毒抽檢，一般為5%，抽檢合格后準備生根。將組培苗在超凈工作臺中轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，本試驗中選擇MS+0.2mg/L IBA，pH=5.8-6.0，每升培養(yǎng)基添加30g蔗糖和7g瓊脂；參考前人方法略有調(diào)整[6]。在培養(yǎng)室培養(yǎng)1個月左右(環(huán)境條件與前期一樣)，觀察各品種幼苗根部生長情況。

1.2.6 幼苗的煉苗與移栽

將幼苗連帶培養(yǎng)瓶全部轉(zhuǎn)移至提前消毒滅菌過的溫室中，前3d遮陰、少通風(fēng)，之后每日增加光照時長，逐漸打開培養(yǎng)瓶蓋，使幼苗逐步適應(yīng)溫室環(huán)境。煉苗約7-10d后，完全打開瓶蓋，用清水沖洗干凈幼苗根部培養(yǎng)基，移栽到32孔穴盤中，穴盤基質(zhì)為不加任何底肥的草莓專用基質(zhì)。進行正常水肥管理，觀察各品種生長情況。

1.2.7 早期開花結(jié)果試驗

穴盤移栽1-2月后，幼苗根部發(fā)育健壯。挑選植株生長正常、根系發(fā)達的健康母株，移栽到花盆中，進行正常管理并觀察記錄開花、結(jié)果等性狀，從中挑選結(jié)果性狀優(yōu)良的原原種苗并標記，后續(xù)可繁殖原種苗和生產(chǎn)苗。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007以及SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。各數(shù)據(jù)指標如下：成活率(%)=(成活莖尖數(shù)/接種莖尖總數(shù))×100%；生根率(%)=(生根幼苗數(shù)/接種幼苗總數(shù))×100%；移栽成活率(%)=(移栽幼苗成活數(shù)/移栽幼苗總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方對不同草莓品種莖尖分化的影響

生長30d左右統(tǒng)計莖尖分化情況，從表1可以看出：MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L GA3培養(yǎng)基適合“紅顏”、“甜查理”、“通州公主”和“小白”4個草莓品種莖尖生長，成活率超過80%，但不適合“京泉香”、“章姬”、“白雪公主”生長。后期還需要對生長不良3個草莓品種莖尖適宜生長培養(yǎng)基配方進行細致研究。

表1 同一培養(yǎng)基對不同品種草莓莖尖誘導(dǎo)分化的影響

2.2 同一培養(yǎng)基配方對不同草莓品種幼苗增殖的影響

莖尖生長40d左右達到增殖標準，經(jīng)過外送病毒檢測后，無病毒的植株選用與接種培養(yǎng)基一樣的配方增殖，其中“白雪公主”莖尖數(shù)量少，長勢很差，放棄增殖。幼苗增殖后置于與莖尖培養(yǎng)相同條件下培養(yǎng)，20d左右觀察幼苗生長情況。從表2可以看出，剩余6個品種草莓中，除甜查理外增殖系數(shù)均在7以上，幼苗生長正常。

表2 草莓幼苗增殖情況統(tǒng)計表

2.3 同一培養(yǎng)基配方對不同草莓品種幼苗生根的影響

增殖30d左右，開始生根培養(yǎng)。采用MS+0.25mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L卡拉膠的瓶裝培養(yǎng)基，參考前人方法略有調(diào)整[6]；每瓶接種5株，培養(yǎng)條件與增殖期相同，生根15d左右，觀察各品種生根情況。從表3可以看出，初期各品種植株生長正常，生根速度較快。培養(yǎng)20d左右，幼苗根部出現(xiàn)黑褐色瘤狀物，根部生長異常。生根培養(yǎng)基配方還需進一步調(diào)整和試驗。

表3 草莓幼苗生根情況統(tǒng)計

2.4 幼苗煉苗與移栽

生根30d后應(yīng)準備煉苗移栽，本試驗中由于移栽場地限制，幼苗生根培養(yǎng)后一直在組培室培養(yǎng)2個月。2021年5月1日-5月5日連帶培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到園區(qū)連棟溫室進行煉苗，前3d采取遮陰措施，室內(nèi)溫度保持在22℃左右。2021年5月6日全部移栽到32孔穴盤中，穴盤基質(zhì)為無底肥草莓專用基質(zhì)，移栽后進行正常管理。其中，京泉香株數(shù)過少，補做后續(xù)結(jié)果試驗。從表4可以看出，不添加底肥的草莓專用基質(zhì)適合幼苗的生長，成活率均在96%以上。

表4 幼苗移栽后成活率

2.5 幼苗花芽分化檢測

移栽約2個月后，待幼苗根系發(fā)達、植株生長良好時，抽樣檢測花芽分化情況，每個品種隨機取樣10株，帶回實驗室在電子顯微鏡下觀察是否有花芽。從表5可以看出，各品種幼苗花芽分化比例差異較大，同一取樣時間下，“甜查理”、“小白”、“通州公主”花芽分化比例較高，“章姬”花芽分化比例最小。

表5 草莓幼苗花芽分化情況統(tǒng)計表

2.6 開花結(jié)果研究

花芽分化檢測完成，將穴盤苗移栽到花盆中進行開花結(jié)果試驗。每盆種植一株，避免根部病害的相互傳染，并且有利于優(yōu)勢植株的選擇與標記。原原種苗種植后，連續(xù)觀察各品種開花、結(jié)果情況，具體定植和開花時間見表6，可以看出原原種苗種植后，陸續(xù)開花結(jié)果，畸形果很少、果實口感佳，植株生長正常。

表6 原原種苗開花時間統(tǒng)計表

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，在同一莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，不同品種草莓莖尖成活情況差異較大，MS添加0.5mg/L6-BA和0.2mg/LGA3適合“紅顏”、“甜查理”、“通州公主”和“小白”莖尖誘導(dǎo)，說明濃度適宜的6-BA和GA3可促進草莓莖尖的誘導(dǎo)分化，前人對“紅顏”草莓的莖尖組培研究結(jié)果也表明：6-BA主要影響草莓的莖尖增殖，KT、GA3和活性炭影響其生長[7]；但是“京泉香”、“章姬”和“白雪公主”莖尖分化率低，說明不同草莓品種莖尖分化所需生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度不同。前人試驗結(jié)果指出培養(yǎng)基MS+0.5mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA適宜“紅顏”、“章姬”草莓莖尖分化[8]；MS+0.5mg/L 6-BA適宜“甜查理”草莓莖尖誘導(dǎo)[9]。

剝離的莖尖大小也可能影響到莖尖的誘導(dǎo)成活情況，前人試驗證明：接種0.3-1.0mm的草莓莖尖都可以誘導(dǎo)出苗，但是莖尖的大小對草莓組培苗的成活率和脫毒率影響比較大，當(dāng)莖尖小于0.5mm時，誘導(dǎo)綠色植株的時間比較長，需要30d，脫毒率可以達到80.0%，但是成活率僅有33.3%。當(dāng)莖尖大小在0.5-0.8mm時，成活率和脫毒率分別為63.3%和68.4%[10]。本試驗中，白雪公主莖尖存活率低可能與剝離莖尖過小和培養(yǎng)基配方不適宜兩個原因均有關(guān)系。

在試驗中發(fā)現(xiàn)，MS添加0.25mg/L IBA有利于草莓組培幼苗的快速生根，但是培養(yǎng)時間超過20d根部異常，說明該培養(yǎng)基不適宜幼苗的長期生長，而前人試驗采用1/2 MS添加0.1或0.3mg/L IBA，“紅顏”草莓根系較長且粗壯[11]，這說明在組培苗生根階段培養(yǎng)基中過多的基本元素可能會影響根部的正常生長。

在幼苗生根培養(yǎng)階段發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)幼苗在培育30d左右會出現(xiàn)葉片發(fā)黃的癥狀，適當(dāng)調(diào)整組培室溫度到18℃左右，葉片全部轉(zhuǎn)綠，恢復(fù)正常生長。說明草莓組培苗在培養(yǎng)后期需要保持較低的環(huán)境溫度，溫度過高容易使幼苗失水發(fā)黃。