菜豆品種資源幼苗期耐堿性鑒定指標(biāo)篩選及綜合評價

蘇藝 馮國軍 劉大軍 楊曉旭 閆志山 劉暢

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150081）

土壤鹽堿化和次生鹽堿化是限制世界灌溉農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素，約11%的灌溉土地受到不同程度的鹽漬化影響（李彬 等，2005；Panta et al.，2014）。由于氣候、地質(zhì)、水文、人為等因素不斷加重，土壤鹽漬化率每年都在增加（Yadav et al.，2011；商振芳 等，2019）；在我國，可使用耕地面積因為全球工業(yè)化、城市化以及土地的鹽漬化快速減少（Shabala et al.，2015；Liu &Wang，2021）。我國是鹽堿地大國，鹽堿地面積占耕地面積的40%，其中東北鹽堿地面積近340 hm（陳麗娜，2020；Feng et al.，2021）。鹽堿地的預(yù)防和治理已經(jīng)成為了科研的聚焦點，挑選適合在鹽堿地種植的品種或具有耐堿性的種質(zhì)是鹽堿地預(yù)防與治理中切實可行的措施之一（高文武 等，2016）。菜豆（L.）是最重要的食用豆類作物之一，含有大量的蛋白質(zhì)、纖維、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)，幾乎占全球食用豆類消耗中的一半（Duc et al.，2015；Torche et al.，2018）。豆類作物能生產(chǎn)富含蛋白質(zhì)的果實和種子，并且能和根瘤菌共生固定土壤中的氮，為鹽堿地土壤肥力的提高做出了巨大貢獻(xiàn)（Yu et al.，2019）。菜豆在我國主要的種植地區(qū)也是我國鹽堿土的主要分布區(qū)域（李建國 等，2012；劉日林 等，2015；趙宣 等，2016）。因此，開展菜豆種質(zhì)資源的耐堿性鑒定和耐堿種質(zhì)篩選，對于菜豆耐堿品種改良、促進(jìn)鹽堿地菜豆栽培具有重要的現(xiàn)實意義。

鹽堿土根據(jù)所含鹽分離子不同分為鹽土、堿土和鹽化-堿化的土（劉杰，2011；孫廣友和王海霞，2016）。堿土中含有過量的NaCO和NaHCO，對植物的毒性比鹽土更大（Feng et al.，2021）。在過去的40 年里，植物耐鹽的生理及分子機(jī)制得到了大量的研究，而對植物耐堿性的研究則相對較少（Lu et al.，2021）。近年來，植物的耐堿性研究逐漸受到重視，多集中在外源物質(zhì)緩解植物堿脅迫研究及其響應(yīng)機(jī)理上，也有耐鹽堿種質(zhì)的鑒定與篩選研究，如Jeannette 等（2002）評估了來自于14 個種共132 份野生菜豆種質(zhì)苗期的耐鹽性，從干質(zhì)量減少量、鹽敏感指數(shù)、根冠比等多個方面進(jìn)行綜合比較評價，得出耐鹽性較好的菜豆種質(zhì)都起源于干旱、沿?；螓}堿地區(qū)；曹帥等（2019）利用主成分分析法及模糊隸屬函數(shù)法對18 個大豆品種進(jìn)行耐堿性的篩選與綜合鑒定；陳二影等（2019）使用主成分分析法與模糊隸屬函數(shù)法對谷子耐鹽堿性進(jìn)行了綜合評價。而關(guān)于菜豆耐堿性機(jī)理及耐堿性鑒定方面的研究卻進(jìn)展緩慢，鮮見報道。

本試驗在水培條件下，以NaHCO模擬堿脅迫條件，測定與植物生長、生理及光合作用相關(guān)的10 個指標(biāo)，使用主成分分析、模糊隸屬函數(shù)法對35個菜豆品種的耐堿性進(jìn)行綜合評價和聚類分析，以期篩選出能快速鑒定菜豆耐堿性的重要指標(biāo)及菜豆幼苗期耐堿性較強(qiáng)及堿敏感的品種，為菜豆耐堿種質(zhì)的選育及菜豆耐堿生理研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料選用35 個菜豆品種，均由黑龍江大學(xué)園藝學(xué)團(tuán)隊提供，編號、品種名稱及來源見表1。

表1 供試菜豆品種編號、名稱及來源

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2021 年7—8月在黑龍江大學(xué)植物生理實驗室完成。

各品種挑選飽滿健康、大小一致的種子，使用5%次氯酸鈉溶液消毒5 min 后，蒸餾水沖洗2～3 min，以蛭石為培養(yǎng)基質(zhì)，將種子播于72 孔的穴盤中，用清水澆灌至蛭石吸飽水，育苗期間及時補(bǔ)充水分保持蛭石濕潤。育苗8 d 后，將菜豆根部蛭石用清水沖洗干凈，轉(zhuǎn)移至水培裝置中培養(yǎng)，營養(yǎng)液配方為0.472 g·L（CaNO）·4HO、0.404 g·LKNO、0.168 g·LKHPO、0.246 g·LMgSO、27.8 mg·LEDTA-2Na、37.2 mg·LFeSO、4.55 mg·LNaBO、1.61 mg·LMnSO、0.22 mg·LZnSO、0.08 mg·LCuSO、0.02 mg·LMoO。培養(yǎng)條件為室溫，每天12 h 光照、12 h 黑暗。培養(yǎng)2 d 后使用預(yù)試驗中得出的最能體現(xiàn)品種間差異的濃度60 mmol·LNaHCO（pH 約8.5）進(jìn)行堿脅迫處理，對照組不進(jìn)行處理。每個品種處理4 株，3 次重復(fù)。每天向水培液中加蒸餾水至刻度線以補(bǔ)充水分損失。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 光合指標(biāo)的測定 脅迫2 d 后，采用Cl-340便攜式手持光合儀測定光合指標(biāo)。每個品種選擇3株生長狀況一致的幼苗，每株選取1 片健康無破損真葉測量凈光合速率、胞間CO濃度及氣孔導(dǎo)度，每個葉片測量3 次取平均值。

1.3.2 丙二醛（MDA）含量的測定 脅迫3 d 后，選擇長勢一致的幼苗真葉進(jìn)行取樣，取樣后迅速放入液氮中，后保存于-80 ℃冰箱中，使用硫代巴比妥酸方法測定MDA 含量。每個品種3 次重復(fù)，每個重復(fù)1 株。

1.3.3 農(nóng)藝性狀的測定 脅迫5 d 后，選取長勢一致的幼苗進(jìn)行農(nóng)藝性狀的測定。采用直尺以子葉結(jié)為分界點測量株高與根長；以子葉結(jié)為分界點稱得地上部與地下部鮮質(zhì)量，烘箱中105 ℃殺青30 min后75 ℃烘干至恒重稱得地上部與地下部干質(zhì)量。每個品種3 次重復(fù)，每個重復(fù)1 株。

1.3.4 綜合評價方法 使用模糊隸屬函數(shù)（D 值）法對供試菜豆品種幼苗期的耐堿性進(jìn)行綜合評價及聚類分析，模糊隸屬函數(shù)計算公式如下：

式中，X為各供試材料基于鑒定指標(biāo)的耐堿系數(shù)；X、X分別為供試材料中該指標(biāo)的最大值和最小值；μ（X）為各供試材料的隸屬函數(shù)值；CV為μ（X）的變異系數(shù)；W即權(quán)重，表示CV在總變異中所占比率；D 表示菜豆品種耐堿性綜合評價值。鑒定指標(biāo)與耐堿性呈正相關(guān)時，用公式（1）計算隸屬函數(shù)值；鑒定指標(biāo)與耐堿性呈負(fù)相關(guān)時，用公式（2）計算隸屬函數(shù)值；用公式（3）計算鑒定指標(biāo)的權(quán)重，公式（4）計算D 值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel 2019 整理試驗數(shù)據(jù)，使用SPSS Statistics 25.0 進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫對菜豆幼苗生長的影響

在堿脅迫下，為消除試驗材料間的差異，使用各指標(biāo)的相對值能更好地體現(xiàn)出不同菜豆品種的耐堿性。與正常條件相比，堿脅迫明顯抑制菜豆幼苗的生長。從表2 可以看出，堿脅迫下不同品種各指標(biāo)變化幅度不同，株高相對值變化幅度為18.11%～100.74%，根長相對值變化幅度為56.70%～122.69%，地上部鮮質(zhì)量相對值變化幅度為11.89%～75.33%，地下部鮮質(zhì)量相對值變化幅度為49.56%～110.58%，地上部干質(zhì)量相對值變化幅度為47.56%～106.80%，地下部干質(zhì)量相對值變化幅度為59.18%～170.00%，MDA 含量相對值變化幅度為87.32%～347.35%，凈光合速率相對值變化幅度為20.87%～105.17%，胞間CO濃度相對值變化幅度為14.40%～97.91%，氣孔導(dǎo)度相對值變化幅度為7.48%～101.96%。

堿脅迫下，輝冠的株高略高于對照，美國黑虎、青冠、青條綠先鋒、1-4-3-1-1 的根長高于對照，菊冠的地下部鮮質(zhì)量高于對照，長龍紅籽架豆的地上部干質(zhì)量高于對照，綠冠、菊冠、14-4-1-3、美國黑虎、香蕉豆、輝冠、錦冠、06-1、22-5-5-1-3、1-4-3-1-1、霞冠、玉冠等12 個品種的地下部干質(zhì)量均高于對照且菊冠比對照高70%。堿脅迫下，除紫冠MDA 含量低于對照外，其他品種MDA 含量均高于對照。粉冠在堿脅迫下凈光合速率、胞間CO濃度和氣孔導(dǎo)度同對照近乎一致，而其他品種凈光合速率、胞間CO濃度與氣孔導(dǎo)度幾乎均被抑制。從各指標(biāo)相對值可以看出，單一指標(biāo)難以區(qū)分菜豆幼苗的耐堿性，因此，需綜合各指標(biāo)來分析菜豆幼苗耐堿性的強(qiáng)弱。

2.2 菜豆品種的耐堿性主成分分析

對菜豆各品種相對株高、相對根長、相對凈光合速率等共10 個指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，各主成分特征值及貢獻(xiàn)率如表3 所示。前4 個主成分的貢獻(xiàn)率分別為32.23%、23.31%、12.54%、10.06%，其累計貢獻(xiàn)率為78.15%。成分載荷是主成分與變量的相關(guān)系數(shù)，其數(shù)值大小表示在降維后綜合變量中的貢獻(xiàn)率高低，同一個變量中，主成分絕對值越大，越能代表該變量（陳重遠(yuǎn) 等，2021）。主成分Ⅰ中，凈光合速率、胞間CO濃度、氣孔導(dǎo)度的絕對值較大，分別為0.703、0.866、0.819，表明主成分Ⅰ代表的是凈光合速率、胞間CO濃度、氣孔導(dǎo)度的信息。主成分Ⅱ中，地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地下部干質(zhì)量的絕對值較大，分別為0.688、0.696、0.858，表明主成分Ⅱ代表的是地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地下部干質(zhì)量的信息。主成分Ⅲ中，根長、地下部鮮質(zhì)量絕對值較大，分別為0.597、0.556，表明主成分Ⅲ代表的是根長、地下部鮮質(zhì)量的信息。主成分Ⅳ中，地上部干質(zhì)量的絕對值較大，為0.705，表明主成分Ⅳ代表的是地上部干質(zhì)量的信息。

表3 4 個主成分特征根值、貢獻(xiàn)率及各因子載荷矩陣

表2 堿脅迫下不同菜豆品種各指標(biāo)相對值 %

綜合分析，由于4 個主成分反映了原來10 個指標(biāo)78.15%的信息，對菜豆耐堿性的影響較大，因此可以用根長、地上部干/鮮質(zhì)量、地下部干/鮮質(zhì)量、凈光合速率、胞間CO濃度及氣孔導(dǎo)度等8 個指標(biāo)作為菜豆耐堿性評價的重要指標(biāo)。

2.3 菜豆品種耐堿性各指標(biāo)隸屬函數(shù)值及權(quán)重

對主成分分析法篩選出的8 個與耐堿性相關(guān)度較高的指標(biāo)采用模糊隸屬函數(shù)法綜合評價菜豆在堿脅迫下的耐受性，各指標(biāo)的權(quán)重如表4 所示，氣孔導(dǎo)度所占權(quán)重最大，為0.156 2，其次為地下部干質(zhì)量和凈光合速率，分別占0.147 9 和0.126 1，占權(quán)重最小的為地上部干質(zhì)量，只占0.094 3。表明氣孔導(dǎo)度、地下部干質(zhì)量及凈光合速率的變化對菜豆幼苗期耐堿能力的影響較大，而地上部干質(zhì)量的變化對菜豆幼苗期耐堿能力的影響較小。

表4 8 個鑒定指標(biāo)的權(quán)重

2.4 堿脅迫下菜豆品種模糊隸屬函數(shù)綜合評價

不同品種各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值如表5 所示。利用公式（4）對不同品種各個指標(biāo)μ 值加權(quán)后相加得到D 值，D 值越大，耐堿性越強(qiáng)。按照D 值大小進(jìn)行排序（表5），D 值排前5 名的分別為粉冠、菊冠、盛冠、06-1、14-4-1-3，D 值排名在后5 名的分別為44-1-1、彎鉤黃、熱那亞、麻子王、泰來白條。

表5 35 個菜豆品種基于8 個鑒定指標(biāo)的隸屬函數(shù)值、D 值及排序

續(xù)表

2.5 基于D 值對35 個菜豆品種進(jìn)行聚類分析

對D 值采用歐式距離法進(jìn)行系統(tǒng)聚類（圖1），35 個菜豆品種被聚為5 類。第Ⅰ類只有1 個品種粉冠，該類群D 值最高，屬于耐堿品種；第Ⅱ類包括14-4-1-3、06-1、菊冠、盛冠等4 個品種，該類群D 值相對較高，屬于相對耐堿品種；第Ⅲ類包括赤裕21 號、豐冠、美國黑虎、長龍紅籽架豆、22-5-5-1-3、黛冠、香蕉豆、綠冠、玉冠、祥冠、霞冠、巨冠、輝冠等13 個品種，該類群D 值中等，屬于中等耐堿品種；第Ⅳ類包括44-1-1、青冠、彎鉤黃、熱那亞、麻子王、黃冠、錦冠、青條綠先鋒、1-4-3-1-1、紅旗油豆、矮生黃金勾、皇冠、金冠、優(yōu)三窄、HG-911、紫冠等16 個品種，該類群D值相對較小，屬于相對堿敏感品種；第Ⅴ類只有1個品種泰來白條，該類群D 值最小，屬于堿敏感 品種。

圖1 35 個菜豆品種的D 值聚類分析

3 討論

3.1 堿脅迫下不同菜豆品種耐堿性指標(biāo)差異

根據(jù)土壤所含鹽分不同，可分為鹽土和堿土，這兩種土壤往往同時發(fā)生，若要解決土壤堿化問題，就要將堿脅迫和鹽脅迫真正區(qū)分開（郭瑞 等，2017）。在相同濃度的NaCl 和NaHCO下，堿脅迫對菜豆幼苗的生長抑制更為嚴(yán)重（Yu et al.，2019）。除了氧化脅迫和離子傷害之外（Munns，2002），堿脅迫下的植物必須應(yīng)對根際周圍的高pH 環(huán)境（Keutgen &Pawelzik，2008），植物根系是最先感應(yīng)堿脅迫的器官，高pH 會影響根系的正常生理功能、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致根系的吸收能力下降（Yang et al.，2008a，2008b）。本試驗中，除菊冠外，堿脅迫后菜豆幼苗地下部鮮質(zhì)量明顯下降，這與前人的研究結(jié)果一致（趙俊香 等，2015）。生物量是反映逆境脅迫下植物適應(yīng)性的指標(biāo)，可以反映逆境脅迫是否得到緩解和緩解程度（許基磊，2020）。趙俊香等（2015）進(jìn)行菊芋苗期耐鹽堿篩選時，耐鹽堿能力較差的菊芋9 號的根部生物量為對照的2 倍，但地上生物量僅占對照的48%；燕麥苗期耐鹽堿性的篩選中，燕麥幼苗鹽堿脅迫后的地下部干質(zhì)量均低于對照（付鸞鴻 等，2019）。本試驗中，堿脅迫下大部分品種地下部干質(zhì)量受到抑制，但有10 個中等耐堿及相對耐堿品種在脅迫后地下部干質(zhì)量高于對照，推測菜豆的耐堿機(jī)制是通過合成更多的物質(zhì)運送到根部，促進(jìn)根系對抗高pH 的環(huán)境所帶來的傷害及維持正常的生理功能，具體的耐堿機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 堿脅迫下不同菜豆品種耐堿性的主成分分析

主成分分析是一種解決多因素問題的有效統(tǒng)計方法，是將多個變量進(jìn)行降維處理，將大量信息囊括在幾個少數(shù)變量中，使其盡可能多地反映原來變量信息的方法（韓麗萍 等，2021）。主成分分析法充分考慮不同指標(biāo)之間的信息重疊，對多維數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，在盡可能保留原有信息的基礎(chǔ)上，對多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，更加客觀地篩選出獨立的綜合因子，避免了主觀隨意性（薛偉鋒 等，2020）。該方法被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，其中也包括使用該方法對植物的耐鹽性、耐密性等進(jìn)行綜合評價（張國新 等，2018；郭琳鈺和李振輪，2021；韓德志 等，2021；李凱 等，2021）。曹帥等（2019）使用主成分分析法得出，主根長、凈光合速率可作為衡量大豆耐堿性與品種篩選的主要指標(biāo)。于崧等（2018）使用主成分分析法將20 個單項指標(biāo)轉(zhuǎn)化為8 個相互獨立的綜合指標(biāo)，并篩選出地上部干質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量等鑒定指標(biāo)可用于不同基因型綠豆耐鹽堿性強(qiáng)弱的快速評價與預(yù)測。張國新等（2018）使用主成分分析法篩選出地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度等8 個指標(biāo)作為綜合評價菊芋耐鹽性的指標(biāo)。李琳等（2016）利用主成分分析法得出全株干質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、根長可作為蕓豆苗期耐鹽堿性的鑒定指標(biāo)。本試驗采用主成分分析法將10 個菜豆幼苗期耐堿性指標(biāo)綜合為4 個主成分，這4 個主成分反映了原來10 個指標(biāo)78.15%的信息，對菜豆耐堿性的影響較大，因此可以用根長、地上部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地下部干質(zhì)量、凈光合速率、胞間CO濃度及氣孔導(dǎo)度等8 個指標(biāo)作為菜豆耐堿性評價的重要 指標(biāo)。

3.3 堿脅迫下不同菜豆品種的綜合評價及聚類 分析

在非生物脅迫下，為了適應(yīng)環(huán)境變化，植物細(xì)胞做出了一系列生理生化過程的改變來保證自身的正常存活與生長（Xuan et al.，2019）。盡管這些生理生化指標(biāo)可以被用來描述品種間的耐堿性差異，但是很難用一個指標(biāo)去準(zhǔn)確、清晰地表達(dá)品種間的耐堿性差異（杜中軍 等，2002）。因此，需要綜合多個指標(biāo)對菜豆各品種幼苗期的耐堿性進(jìn)行評價。模糊綜合評價法是借助模糊數(shù)學(xué)中的隸屬度理論把定性評價轉(zhuǎn)化為定量評價，即對受到多種因素制約的事物或?qū)ο笞龀鲆粋€整體的評價（薛偉鋒 等，2020）。前人使用模糊隸屬函數(shù)法對不同加工番茄品種的耐鹽性（許立志 等，2017）、甜高粱孕穗期的耐鹽性（高雪 等，2018）以及大豆品種苗期耐鹽堿性（曹帥 等，2019）等進(jìn)行了綜合評價。本試驗中使用模糊隸屬函數(shù)法對35 個菜豆品種的耐堿性進(jìn)行綜合評價，并對綜合評價值（D 值）進(jìn)行聚類分析，將菜豆品種按照耐堿性不同分為5 類，其中，30 個菜豆品種都為中等耐堿、相對堿敏感及堿敏感品種，推測菜豆大部分品種幼苗期對堿脅迫的耐受性都不高。

4 結(jié)論

通過對35 個菜豆品種幼苗期耐堿性的10 個指標(biāo)進(jìn)行分析，可以看出堿脅迫對菜豆幼苗的生長及光合均有抑制作用，并且會不同程度地破壞細(xì)胞膜。通過主成分分析篩選出根長、地上部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地下部干質(zhì)量、凈光合速率、胞間CO濃度及氣孔導(dǎo)度等8 個指標(biāo)可以作為菜豆幼苗期堿脅迫鑒定的重要指標(biāo)，通過模糊隸屬函數(shù)法綜合評價和聚類分析，35 個菜豆品種可被劃分為5 類：Ⅰ類為耐堿品種，只有1 個品種；Ⅱ類為相對耐堿品種，共4 個品種；Ⅲ類為中等耐堿品種，共13 個品種；Ⅳ類為相對堿敏感品種，共16 個品種；Ⅴ類為堿敏感品種，只有1 個品種。