植物乳桿菌WL-R-02凍干保護劑配方的優(yōu)化

◆作者：李鳳娟

◆單位：遼寧威蘭生物技術(shù)有限責任公司

植物乳酸菌（LacLoba-cillus planlarum）具備免疫調(diào)節(jié)、抑制病原微生物、維持腸道菌群平衡和促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收等很多保健作用，同時也廣泛應用于微生物制劑（劉利利等，2020）。國內(nèi)凍干乳酸菌發(fā)酵劑商品化生產(chǎn)不足，主要原因是凍干乳酸菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)技術(shù)還不是很完善，細胞存活率低，保存時間短（杜磊等，2017）。真空冷凍干燥（簡稱凍干）技術(shù)出現(xiàn)在1811年左右，當時主要用于生物體的脫水。1813年由美國人Wollaston發(fā)現(xiàn)水的飽和蒸汽壓與水溫有

關(guān)，1909年shackell將其用于了干燥細菌。經(jīng)過一個世紀，在1935年第一臺商業(yè)凍干機問世。目前凍干機已經(jīng)在醫(yī)藥行業(yè)普遍應用。乳酸菌菌粉可以采用真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等不同的方法進行制備。真空冷凍干燥法因獲得的發(fā)酵劑含活菌數(shù)高，發(fā)酵活力強，遺傳性穩(wěn)定，便于儲藏，攜帶方便，使用安全等優(yōu)勢而被廣泛地應用（曾小群等，2013）。駱承庠、劉振民等研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌經(jīng)過凍融處理后，致死率增加。引起致死損傷的主要因素是機械效應、溶質(zhì)效應和干燥效應（劉振民等，2002）。許多研究發(fā)現(xiàn)在乳酸菌凍干前加入適當?shù)奈镔|(zhì)能起到保護作用，在冷凍干燥的細菌中加入保護劑可以改變生物樣品冷凍干燥時的物理、化學環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥或復水對細胞的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性，因此對于絕大多數(shù)細菌冷凍干燥成功的關(guān)鍵在于有效保護劑的使用。許多研究也發(fā)現(xiàn)凍干保護劑不僅影響乳酸菌在凍干過程中的細胞存活率，還影響保藏期間的細胞穩(wěn)定性（張英華等，2005）。保護劑間合理的復配方式有助于優(yōu)勢的互補，更大程度地發(fā)揮保護效果，也是乳酸菌商業(yè)化的關(guān)鍵因素；正交試驗設(shè)計（OrthogonalExperimentalDesign）是從“均勻分散、整齊可比”的角度出發(fā)，以拉丁方理論和群論為基礎(chǔ)，從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗的一種方法。它利用正交表來安排與分析多因素試驗，進而減少我們試驗的次數(shù)，適用于因素水平不太多的多因素試驗（代志凱等，2010）。本研究通過對實驗室現(xiàn)有保護劑成分進行正交試驗，確定凍干保護劑最優(yōu)組合，獲得凍干存活率高的乳酸菌，為開發(fā)商品化專用直投式發(fā)酵菌劑提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要材料

菌種：乳酸菌WL-R-02（威蘭生物菌種庫保存菌株）。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，硫酸鎂0.58 g/L。若制作固體培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂粉即可。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母粉15.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，硫酸鎂1.0g/L，硫酸錳0.05g/L。

保護劑配料：脫脂乳（新西蘭FonterraLtd生產(chǎn)）、海藻糖（德州匯洋生物科技有限公司生產(chǎn)）、乳糖（美國LeprinoFoods生產(chǎn)）、L-半胱氨酸（河北鵬宇生物科技有限公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗儀器

LYO-4.0真空冷凍干燥機、LD-5電動離心機、HYQ1800生物搖床、DH6000II型電熱恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ-2F潔凈工作臺；752紫外分光光度計。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌粉的制備與檢測方法

菌泥的制備：取植物乳桿菌WL-R-02凍存管，接種于MRS培養(yǎng)基，37℃下厭氧靜置培養(yǎng)12～24h。挑取具有典型形態(tài)的菌落，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃下厭 氧 培 養(yǎng)16～20h，3000～3500 r/min條件下離心20～30min，收集菌泥。

菌粉的制備：將收集到的菌泥加入適量生理鹽水重新懸浮。在菌懸液中，加入不同組別的凍干保護劑，充分攪拌溶解后，取樣檢測活菌數(shù)；然后，分裝于西林瓶中，每瓶3mL，每組10個重復。將各組樣品置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥38～40h，出箱后即得凍干菌粉。取樣檢測有效活菌數(shù)，計算存活率。

活菌數(shù)的檢測：采用MRS平板計數(shù)法，梯度稀釋至約30～300個菌/mL后涂平板，置于37±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后計數(shù)。

凍干存活率計算方法：

存活率/%=凍干后3mL菌懸液的活菌總數(shù)/凍干前3 mL菌懸液的活菌總數(shù)×100。

1.3.2 凍干保護劑配方優(yōu)化

選定脫脂奶粉、海藻糖、乳糖、L-半胱氨酸進行四因素二水平試驗（表1）。

表1 乳酸菌保護劑正交試驗因素水平表

考慮脫脂乳與海藻糖、乳糖均有交互作用，海藻糖與乳糖均為小分子糖，存在交互作用；自由度f=4×1+3×1=7；根據(jù)L8（27）交互作用列表設(shè)計四因素二水平三交互實驗（見表2）。

表2 乳酸菌保護劑L8（27）交互作用正交表

正交試驗得出的最優(yōu)復合保護劑不在正交試驗組別中，則與1.3.1相同條件再次凍干，測定最終存活率。

1.3.3 耐高溫考察：

最佳處理工藝條件下制備的菌粉，分別置于4℃、37℃、42℃條件下進行貯存，10d后進行取樣測活菌數(shù)，計算存活率。

2 結(jié)果

2.1 凍干保護劑配方優(yōu)化

復合保護劑中的物質(zhì)由于種類不同，其對菌體的保護方式也不同，各保護劑成分比例不同，菌粉的活菌數(shù)也就不同（見表3），優(yōu)化保護劑比例將會提高菌體的細胞存活率。

表3 保護劑配方對活菌數(shù)影響試驗的結(jié)果

由表3、表4可以看出：因素中對存活率的影響依次為D＞C＞B＞B×C＞A×B＞A＞A×C，L-半胱氨酸＞海藻糖＞乳糖＞脫脂乳，其中脫脂乳的作用次于海藻糖/乳糖、脫脂乳/海藻糖的交互作用有關(guān)，根據(jù)二元表確定脫脂乳含量為A2（13%），得出保護劑組合（A2B1C1D1）可使得存活率最高，因此確定最佳復合保護劑配方為：13%脫脂乳、4%海藻糖、3%乳糖、1.0%半胱氨酸。

表4 保護劑配方對活菌數(shù)影響試驗的結(jié)果分析

對最佳凍干保護劑組合：13%脫脂乳、4%海藻糖、3%乳糖、1.0%半胱氨酸。重復性試驗結(jié)果凍干前乳酸菌活菌數(shù)為1.40×1010CFU/mL，凍干后乳酸菌活菌數(shù)達到了 1.28×1010CFU/mL，存活率達91.6%，最佳保護劑組合凍干后的活菌數(shù)均大于正交試驗各組的活菌數(shù)，普遍高于正交各實驗組結(jié)果。最終活菌數(shù)為6.70×1010CFU/g，達到了比較理想的凍干保護效果。

2.2 耐高溫考察

由表5可以看出：4℃條件下10d，存活率為98.96%，趨于穩(wěn)定。37、40℃條件下10d活菌數(shù)下降了1～2個數(shù)量級，存活率分別為4.48%和1.22%；顯示不同溫度下儲存10d，隨著溫度的升高，存活率下降。低溫有利于植物乳桿菌WL-R-02的保存。

表5 乳酸菌不同存放溫度下活菌數(shù)變化情況（CFU/g）

3 討論與結(jié)論

3.1 凍干保護劑配方優(yōu)化

本試驗得出針對WL-R-002乳酸菌植物的保護劑最佳配方組合為：13%脫脂乳、4%海藻糖、3%乳糖、1.0%半胱氨酸。在最優(yōu)配方保護劑下存活率為91.6%，最高活菌數(shù)為6.70×1010CFU/g。復合保護劑比單一保護劑保護性更好，這主要是因為復合保護劑之間可能存在互補作用。本研究復合保護劑各成分對WL-R-002凍干存活率的影響主次順序為：L-半胱氨酸＞海藻糖＞乳糖＞脫脂乳；有研究發(fā)現(xiàn)，L-半胱氨酸中的氨基可與菌體蛋白質(zhì)上的羧基相互作用，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，防止凍干過程中因脫水而導致的蛋白質(zhì)聚集，從而達到保護作用；同時，L-半胱氨酸具有抗氧化作用，可以防止細胞膜中不飽和脂肪酸在冷凍干燥過程中被氧化，保持細胞膜良好的流動性（CarvalhoAS，2003）。Hubel（2007）和Zayed（2004）分別從“玻璃體學說”和“水替代假說”角度表明海藻糖和小分子糖在菌體保護中的作用，海藻糖分子能減少保存以及復水過程中細菌細胞的死亡，具有明顯的增強耐熱的功能。海藻糖由于具有多個羥基，可以與菌體表面自由基聯(lián)結(jié)起來，避免菌體暴露在介質(zhì)中，還可與蛋白質(zhì)形成氫鍵以取代水，保證蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；另一方面在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，減少了游離水的含量并增加了溶液的黏性，從而減緩晶核的生長過程，使形成的冰晶較細小，以達到保護細胞的目的（Vinderola，2002）。小分子糖、山梨醇的加入可提高干燥升華速度（Santivarangkna，2007）。脫脂乳等天然合成的高分子物質(zhì)，它們在凍干生物制品中主要起骨架作用，使凍干制品形成多孔性、疏松的海綿狀物，從而使溶解度增加（Vasiljevic，2003）。

本實驗對四個候選凍干保護劑進行正交實驗確定最優(yōu)組合，最優(yōu)復合保護劑下對WL-R-002乳酸菌凍干存活率為91.6%。秦鵬等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌在保護劑配方為：低聚果糖2.66%、脫脂乳粉10.11%、海藻糖5.90%，凍干存活率達到89.43%。陳勝杰等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌：可溶性淀粉10%，VC鈉鹽3%，脫脂乳粉12%，低聚木糖14%;凝結(jié)芽孢桿菌：低聚木糖8%，VC鈉鹽4%，可溶性淀粉14%，脫脂乳粉8%;釀酒酵母菌：低聚木糖10%，VC鈉鹽2%，脫脂乳粉12%，可溶性淀粉12%。添加最優(yōu)保護劑組合，三株菌的凍干存活率分別為83.2%、83.7%和86.7%，從實驗結(jié)果來看，不同的菌株對凍干保護劑的復配配方需求也不盡相同，比例也各有差別，說明菌株本身的特性也是影響保護劑選擇的主要因素。辛國芹等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，通過正交試驗篩選出植物乳桿菌保護劑配方：脫脂奶粉25%，海藻糖7.5%，甘油0.75%，凍干存活率可達91.01%。景安琪等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌菌株686在保護劑配方為脫脂乳12.5g/100 mL，海藻糖6.0g/100mL，谷氨酸鈉14.5g/100mL，凍干存活率為81.59%。本文研究成果存活率91.6%不低于以上研究成果，本試驗得到的復配劑配方具有一定的借鑒意義。

3.2 耐高溫考察

本實驗對凍干后的菌粉在4℃冷藏保存10d，與0d相比存活率為98.96%，冷藏保存數(shù)據(jù)穩(wěn)定，在37℃、42℃下高溫保存10d，存活率分別為4.48%和1.22%。董佩佩等研究，通過對九種耐熱保護劑的篩選出2%谷氨酸鈉組對植物乳桿菌的保護效果略好，37℃條件下10d存活率為0.61%，42℃條件下10d存活率為1.92%（董佩佩等，2018）。與本實驗結(jié)果4.48%和1.22%比較，結(jié)果相當。

4 小結(jié)

本研究得出植物乳桿菌保護劑最佳配方組合為：13%脫脂乳、4%海藻糖、3%乳糖、1%半胱氨酸。在最優(yōu)配方保護劑下存活率為91.6%，最高活菌數(shù)為6.70×1010CFU/g，本研究僅對凍干保護劑的配方進行優(yōu)化，未對凍干工藝參數(shù)進行深入化整體性的優(yōu)化，因此，后續(xù)可以通過對凍干工藝參數(shù)的優(yōu)化，以達到進一步提升菌粉活菌數(shù)目的。為下一步開發(fā)商品化專用直投式發(fā)酵菌劑提供技術(shù)支撐，為益生菌新型飼料的開發(fā)提供參考。

參考文獻：（略）