不同消毒處理對葡萄外植體成活率的影響

閆百玲，閆德明

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)建設項目管理站，甘肅 蘭州 730046；2.甘肅建筑職業(yè)技術學院，甘肅 蘭州 730050）

葡萄是世界第二大水果，有著悠久的栽培歷史[1]。我國西北地區(qū)具有栽培葡萄得天獨厚的自然條件[2]，為解決傳統(tǒng)育苗周期長等缺點，利用植物組織培養(yǎng)進行外植體系的建立迫在眉睫。近年來，國內(nèi)外對葡萄組織培養(yǎng)的研究越來越多，其中利用“組培法”提高苗木繁殖系數(shù)的研究備受重視[3-4]。葡萄扦插技術不能獲得大量的脫毒苗，傳統(tǒng)的育種技術很難獲得抗病葡萄品種，組織培養(yǎng)技術對葡萄無病毒株系建立、轉基因葡萄育種研究提供了技術支持[5]。僅僅依靠扦插繁殖和莖尖培養(yǎng)難以滿足生產(chǎn)需要，單芽莖段繁殖為葡萄苗木的大量繁殖提供了一個新的有效的方法和途徑[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料預處理和消毒

選取4 年生葡萄植株，剪取春季萌發(fā)的新梢，選擇長勢基本一致的紅地球和陽光玫瑰枝條，所剪取的枝條長勢旺盛，枝條芽點飽滿，用2 封報紙包好，注明品種后迅速拿回實驗室，用滅過菌的剪刀將新梢剪成5～6 cm 帶腋芽的單芽莖段，在剪的過程中剪除葉片留下葉柄，然后將紅地球和陽光玫瑰2 個品種單芽莖段放在已消毒的燒杯內(nèi)，并用紗布包扎好，注明品種名，流水沖洗3 h，倒完積水后轉入超凈工作臺，用火焰滅菌的剪刀剪去病蟲枝、傷殘枝、小葉片后，將其剪成短于廣口瓶的枝條，放入經(jīng)干燥滅菌的廣口瓶中。

倒入無菌水沖洗和浸泡1 次，倒出無菌水加入70%酒精，浸泡并搖動10 s；迅速倒出酒精加2%次氯酸鈉溶液浸泡8 min，并搖動；倒出次氯酸鈉并用0.1%升汞浸泡，3 個處理各搖動3 min、5 min、7 min倒出，用無菌水沖洗5 次。最后將消毒的枝條取出，放入滅過菌鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中吸干水，每個處理只用1 個培養(yǎng)皿，并再用無菌剪刀剪除受傷斷面，最后留2 cm 左右，注意枝條的滅菌消毒過程必須在無菌條件下進行操作。

1.2 消毒處理方法

處理A：70%酒精10 s+2%次氯酸鈉8 min+0.1%升汞3 min；處理B：70%酒精10 s+2%次氯酸鈉8 min+0.1%升汞5 min；處理C：70%酒精10 s+2%次氯酸鈉8 min+0.1%升汞7 min。

1.3 外植體轉接

消毒完畢后，在無菌條件下用剪刀將枝條剪成2.0 cm 左右的單芽莖段，下段梢長、上段較短，但剪口距芽至少0.5 cm。再用鑷子將其豎直插入改良B5培養(yǎng)基中。插完后在火焰上旋轉數(shù)秒，立即塞嚴棉塞和包頭紙，并在瓶體外寫明品種名稱、編號，然后將其放置于環(huán)境溫度25±3 ℃、相對濕度70%左右、每日光照2 000 lx 以上、12～18 h 的培養(yǎng)室中進行初代培養(yǎng)。

1.4 測定

1.4.1 測定時間 接種4 d 后開始觀測污染、萌芽、生根以及株高情況，污染率每天觀測1 次，共4 次。接種5 d 后統(tǒng)計發(fā)芽率、生根率、株高，并每隔3 天觀測1 次，共4 次。

1.4.2 污染率測定 統(tǒng)計污染瓶數(shù)。

1.4.3 發(fā)芽率測定 記錄發(fā)芽個數(shù)。

1.4.4 生根率測定 統(tǒng)計生根數(shù)量。

1.4.5 累計根長測定 對接種10 d 后的12 d 內(nèi)累計根長進行測定（每隔3 天觀測1 次，共4 次）

統(tǒng)計根長并計算累計根長。

2 結果與分析

試驗消毒處理中，處理B、處理C 消毒的外植體，在無菌水清洗過程中有較多的幼嫩組織和殘渣隨無菌水流出，顏色發(fā)黃；而處理A 的沖洗水較澄清，初步說明高濃度的、長時間的消毒處理已殺死部分幼嫩組織；2 個品種的處理C 外植體幼嫩莖處略發(fā)黑。

根據(jù)日常的觀察和測量所知，剛剛接種后的前幾天內(nèi)植株生長很弱，尤其是7 min 升汞處理下的外植體，葉片發(fā)育不全、畸形生長，葉緣發(fā)黑，明顯受到升汞等消毒試劑的毒害。試管苗的大量生根從接種10 d 后開始，并且主根如果沿順時針方向延伸，則須根沿逆時針方向延伸，根系以最大限度的利用空間，當根系長到大概1.5 mm時，開始長須根，并且須根成對排列。供試試管苗的根系到接種后25 d 左右，根粗達到最大值，此后基本上不再增粗，以大量長須根為主，并且根據(jù)統(tǒng)計結果顯示，最粗主根達到3 mm，是紅地球品種的處理B。

試管苗的生長表現(xiàn)也不一致。有些試管苗已發(fā)芽，但始終沒有生根，此類不生根的試管苗隨著培養(yǎng)時間的延長葉片發(fā)黃失綠，株高生長到一定程度就不再生長，玻璃化現(xiàn)象多發(fā)生在不生根的試管苗內(nèi)。不生根的試管苗生長與外植體的大小、粗細有關。越粗、越長的外植體株高越高。由此可以判斷，外植體在未生根以前是利用外植體內(nèi)儲藏的營養(yǎng)供芽生長，等到材料內(nèi)儲藏的營養(yǎng)消耗殆盡，植株停止生長，并漸漸出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

已發(fā)芽的生根試管苗和不生根試管苗，葉片從葉緣葉尖處發(fā)黃，表現(xiàn)出缺少微量Mn 等元素癥狀，但是此后的培養(yǎng)使已生根的試管苗逐步恢復綠色，葉片逐漸變?yōu)檎Ｈ~片，而未生根的試管苗，葉片葉緣葉尖黃化越來越嚴重。由此可知，所采集的外植體材料本身就缺少Mn 等微量元素，而已生根的植株可以通過根系吸收培養(yǎng)基中的微量元素以緩解葉片葉緣葉尖黃化。

外植體材料的粗細和大小對本試驗影響也較大。瘦弱的外植體基本不發(fā)芽、不生根、剪切口處局部發(fā)黑，酒精等試劑對材料的傷害嚴重。不生根的試管苗主要是外植體基部發(fā)黑，隨著培養(yǎng)時間延長，愈傷組織也逐漸發(fā)黑，說明材料的粗細和大小對不同的消毒處理方式很敏感。

外植體先長出愈傷組織，然后從愈傷組織中分化出根，并且愈傷組織越多，愈傷組織越白、越干凈，生根越多、越粗、越長，根系越發(fā)達。

2.1 不同消毒方式對污染率的影響

紅地球品種的處理中，處理C 的效果最好，污染率為0，處理A 效果最差，污染率為33.3%，平均污染率為13.3%；陽光玫瑰的處理中，處理B 的效果最好，污染率為10%，處理A 效果最差，污染率為54.5%，平均污染率為34.8%。說明紅地球葡萄品種外植體材料容易消毒，隨著消毒時間的增加，消毒效果越好，污染率逐漸降低（圖1、圖2）。

圖1 紅地球綜合指標統(tǒng)計

圖2 陽光玫瑰綜合指標統(tǒng)計

2.2 不同消毒方式對發(fā)芽率的影響

紅地球品種的3 個處理中，處理B 的效果最好，發(fā)芽率達到92.3%；陽光玫瑰的3 個處理中，也是處理B 效果最好，發(fā)芽率達到80%。紅地球品種的平均發(fā)芽率為91.3%，陽光玫瑰的平均發(fā)芽率為64.5%。說明5 min 0.1%升汞處理下，對外植體芽的生長最利。處理時間過長，材料容易受升汞毒害，芽的萌發(fā)推遲，甚至不發(fā)芽；處理時間過短，消毒不徹底，材料帶菌，仍不發(fā)芽（圖1、圖2）。

2.3 不同消毒方式對生根率的影響

紅地球品種的處理中，處理C 的效果最好，生根率為80%，處理B 的效果最差，生根率為30.8%，平均生根率為48%；陽光玫瑰的處理中，處理C 的效果最好，生根率為30%，效果最差的為處理A，生根率為0%，平均生根率為16.7%。說明7 min 升汞處理下的外植體材料，生根效果最好（圖1、圖2）。

2.4 不同消毒方式對累計根長的影響

紅地球處理C 的效果最好，12 d 的累計根長為21.8 cm，效果最差的為處理B，累計根長為12.5 cm，紅地球品種的平均累計根長為16.4 cm；陽光玫瑰品種的處理中，效果最好的也是處理C,累計根長為17.4 cm，效果最差的為處理A，累計根長為0 cm，平均累計根長為8.2 cm（圖3、圖4）。

圖3 紅地球立即根長統(tǒng)計

圖4 陽光玫瑰累計根長統(tǒng)計

2.5 綜合分析

綜合觀測指標顯示：在70%酒精10 s+2%次氯酸鈉8 min 消毒的基礎上，7 min 升汞處理對紅地球和陽光玫瑰品種處理效果最佳。7 min 升汞處理下，2 個品種的污染率、發(fā)芽率、生根率、累計根長等綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)良，植株長勢迅速，生根量多。其中，紅地球品種的污染率低于陽光玫瑰，發(fā)芽率高于陽光玫瑰，平均累計根長長于陽光玫瑰。在3 min、5 min、7 min 0.1%升汞處理下，隨著消毒時間的增加，外植體的污染率明顯降低，并且污染率低的成活率高。

3 討論與結論

3.1 討論

影響外植體污染的因素：一是消毒不徹底；二是外植體的大小和取材季節(jié)的影響，越靠近基部較低部位的外植體，污染率越低，莖尖最好，莖段最廣泛；三是器官的生理狀態(tài)和生理年齡，生理年齡越小，越易誘導根和芽的發(fā)生[4]；四是幼嫩的枝條越容易消毒，污染率越低；五是修剪過程中機械損傷越少，污染率越低；六是多年生木本植物和大田作物帶菌多，污染率較高。

影響外植體發(fā)芽的因素：一是莖芽和根的分化取決于生長素/細胞分裂素的比例[8]；二是培養(yǎng)基中生長素濃度過高會抑制芽的形成[9]；三是供試材料的生理狀態(tài)和芽的飽滿程度，外植體中儲藏的營養(yǎng)越多，越容易發(fā)壯芽。

影響試管苗生根的因素：一是外植體材料；二是基本培養(yǎng)基[10]；三是植物激素，一般生長素類能促進生根；四是繼代培養(yǎng)代數(shù)；五是黑暗中培養(yǎng)比光照培養(yǎng)下更容易產(chǎn)生不定根[11]。

本試驗在統(tǒng)計過程中存在一些誤差，主要受外植體材料的大小、粗細的影響。以后的研究中應將各外植體按粗細、大小平均分級，按不同粗細程度確定最佳消毒時間。

此次消毒只是針對外植體材料表面滅菌，未能消滅材料內(nèi)部細菌，未降低污染率，可在培養(yǎng)基中加入抗生素以降低污染。

為證實試管苗的污染是由材料帶菌還是培養(yǎng)環(huán)境本身有菌，應在培養(yǎng)架上放置一個空培養(yǎng)基，其內(nèi)不接任何外植體，最后觀察該空培養(yǎng)基的污染狀況。為降低污染，應在培養(yǎng)前用70%酒精在空氣中噴霧，殺死空氣中的部分細菌。

消毒后，用剪刀剪除一部分受傷斷面后，接種后仍有一部分莖段斷面發(fā)黑，說明材料的粗細程度和消毒液的滲透速度有關，如果能夠把握住材料粗細和消毒液在組織內(nèi)的滲透速度以及滲透速度的關系后，材料基部發(fā)黑和只發(fā)芽不生根的現(xiàn)象也許會扭轉。

3.2 結論

試驗結果表明：70%酒精10 s+2%次氯酸鈉8 min+0.1%升汞7 min 處理下污染率低，生根率、發(fā)芽率、成活率高；外植體材料粗，芽眼越飽滿，污染率越低，成活率越高。