運(yùn)用宏基因組二代測(cè)序診斷鸚鵡熱衣原體重癥肺炎2 例

王佳麗 劉 健 曹慧丹

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，天津 300250

鸚鵡熱衣原體肺炎是由鸚鵡熱衣原體感染引起的肺部炎性疾病[1]，由于該病初期臨床表現(xiàn)缺乏特異性，傳統(tǒng)診斷方法具有局限性，常因治療不及時(shí)出現(xiàn)呼吸困難等危及生命的重癥肺炎表現(xiàn)[2]。第二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS），也稱為高通量或大規(guī)模并行測(cè)序，是一種允許數(shù)千到數(shù)十億個(gè)DNA 片段同時(shí)獨(dú)立測(cè)序的技術(shù)類型[3]。宏基因組二代測(cè)序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術(shù)是基于NGS 平臺(tái)，快速獲取臨床樣本中所有的核酸序列，通過與特定的數(shù)據(jù)庫(kù)比較，從而得到樣本中微生物種屬信息的技術(shù)[4]。近年來mNGS 技術(shù)在感染性疾病診療中的優(yōu)勢(shì)逐漸引發(fā)關(guān)注?，F(xiàn)報(bào)道天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科運(yùn)用mNGS 技術(shù)診斷2 例鸚鵡熱衣原體重癥肺炎病例。

1 病歷資料

病例1，男，70 歲，因“間斷發(fā)熱10 d，伴咳嗽咳痰3 d”于2021 年6 月10 日收入我院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科?；颊呷朐呵?0 d 無明顯誘因出現(xiàn)間斷發(fā)熱，體溫最高達(dá)39.7℃，伴寒戰(zhàn)、肌肉酸痛，自行服藥后癥狀未緩解。入院前3 d 患者上述癥狀加重，伴咳嗽咳痰，痰少不易咳出，乏力，偶有頭痛、惡心，于我院門診查胸CT 示右肺炎癥伴雙側(cè)少量胸水，以“肺炎”收入院?；颊呒韧懈哐獕?、糖尿病、冠心病史。查體：急性面容，神志清楚，精神狀態(tài)較差，雙肺呼吸音粗，右肺可聞及濕啰音，余無明顯異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：白細(xì)胞計(jì)數(shù)11.10×109/L，中性粒細(xì)胞百分比94.00%，紅細(xì)胞沉降率83 mm/h，C 反應(yīng)蛋白為401.00 mg/L，降鈣素原為11.68 ng/ml，血?dú)夥治鎏崾劲裥秃粑ソ撸窝字гwIgM 測(cè)定、冷凝集試驗(yàn)、痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)（需氧+厭氧）、曲霉菌抗原檢測(cè)、1-3-B-D 葡萄糖檢測(cè)均未見明顯異常。先后予頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、莫西沙星、美羅培南抗感染治療，配合經(jīng)鼻高流量氧療改善氧合，入院第8 天患者胸CT 提示兩肺炎癥，雙側(cè)胸腔積液較前增加?？紤]患者肺部感染進(jìn)展較快，廣譜抗生素治療無效，病原學(xué)診斷尚不明確，遂行床旁纖維電子支氣管鏡下肺泡灌洗，留取氣道分泌物行細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌，真菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)白色念珠菌，留取支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）送檢mNGS 發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌（特異序列數(shù)為61 752 個(gè)）、鸚鵡熱衣原體（特異序列數(shù)為68 個(gè)）、白色念珠菌（特異序列數(shù)為65 個(gè)）和葡萄牙棒孢酵母（特異序列數(shù)為35 個(gè)）。追問病史，患者發(fā)病前曾救治處理傷鳥。結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果及鳥類接觸史，診斷為“重癥社區(qū)獲得性肺炎，鸚鵡熱衣原體感染，銅綠假單胞菌感染，真菌感染，Ⅰ型呼吸衰竭，胸腔積液”?？垢腥痉桨刚{(diào)整為鹽酸多西環(huán)素膠囊100 mg，2 次/d，口服；氟康唑氯化鈉注射液400 mg，1 次/d，靜脈滴注。入院第13 天患者行B 超引導(dǎo)下胸腔閉式引流術(shù)。經(jīng)治療患者癥狀緩解，感染指標(biāo)恢復(fù)正常，缺氧改善，胸CT 提示雙肺炎癥轉(zhuǎn)歸期，雙側(cè)胸水較前明顯減少?；颊叱鲈汉罄^續(xù)口服鹽酸多西環(huán)素膠囊100 mg，1 次/d，氟康唑片200 mg，1 次/d。1 個(gè)月后門診復(fù)查胸CT 提示肺部病變明顯吸收。該患者胸CT 表現(xiàn)見圖1。

圖1 胸CT 表現(xiàn)

病例2，男，69 歲，因“間斷發(fā)熱3 d”于2021 年7 月11 日收入我院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科?；颊呷朐呵? d 受涼后出現(xiàn)發(fā)熱，最高體溫38.5℃，伴頭暈頭痛，后于我院急診查血常規(guī)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)9.55×109/L，中性粒細(xì)胞百分比80.90%，C 反應(yīng)蛋白為103.18 mg/L，降鈣素原為0.08 ng/ml，胸CT 提示左肺上葉炎性病變。初始抗感染治療3 d 后，患者上述癥狀未見好轉(zhuǎn)，伴見咳嗽，痰少色白，偶有惡心，納差，以“肺炎”收入院?；颊呒韧刑悄虿?、高血壓病史，二尖瓣及主動(dòng)脈瓣換瓣手術(shù)史。查體：神志清楚，精神狀態(tài)一般，左肺呼吸音粗，可聞及少量干啰音，余無明顯異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：白細(xì)胞計(jì)數(shù)7.12×109/L，中性粒細(xì)胞百分比82.50%，C 反應(yīng)蛋白為204.00 mg/L，降鈣素原為0.29 ng/ml。肺炎支原體IgM 測(cè)定、冷凝集試驗(yàn)、痰抗酸染色、痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)（需氧+厭氧）均未見明顯異常。先后予莫西沙星、頭孢曲松抗感染治療。入院第7 天患者仍間斷發(fā)熱，咳嗽咳痰加重，復(fù)查血常規(guī)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)8.50×109/L，中性粒細(xì)胞百分比89.20%，C 反應(yīng)蛋白為348.00 mg/L，降鈣素原為0.74 ng/ml，血?dú)夥治鎏崾劲裥秃粑ソ?，調(diào)整用藥方案為美羅培南聯(lián)合莫西沙星以抗感染，配合注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉以抗炎。為進(jìn)一步明確病原學(xué)診斷，行纖維電子支氣管鏡下肺泡灌洗，留取氣道分泌物行細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)、抗酸染色均未見明顯異常，留取BALF 送檢mNGS 發(fā)現(xiàn)鸚鵡熱衣原體（特異序列數(shù)為130 個(gè)）和人巨細(xì)胞病毒（特異序列數(shù)為1 個(gè)）。詳詢病史，患者自訴發(fā)病前曾近距離接觸鳥雀。結(jié)合臨床表現(xiàn)、病原體檢測(cè)結(jié)果及鳥類接觸史，診斷為“鸚鵡熱衣原體重癥肺炎”，停用當(dāng)前抗生素，予鹽酸多西環(huán)素膠囊100 mg，2 次/d，口服。經(jīng)治療患者病情好轉(zhuǎn)，出院時(shí)胸CT 提示肺部炎性病變明顯吸收。出院后門診隨訪。該患者胸CT 表現(xiàn)見圖2。

圖2 胸CT 表現(xiàn)

2 討論

鸚鵡熱衣原體是一種具有雙相發(fā)育周期的專性胞內(nèi)球形革蘭氏陰性菌[5]，其自然宿主為鳥類[6]。人類是鸚鵡熱衣原體的偶發(fā)宿主，主要通過吸入受感染鳥類的尿液、糞便或其他排泄物所產(chǎn)生的氣溶膠被感染[5]，潛伏期為5～14 d[1]。本文2 例患者均有鳥類接觸史，是診斷鸚鵡熱的重要依據(jù)之一。鸚鵡熱的臨床表現(xiàn)以流感樣癥狀或非典型肺炎為多見，不同患者疾病嚴(yán)重程度不一[7-8]。一項(xiàng)回顧性研究[5]顯示，約1%的社區(qū)獲得性肺炎由鸚鵡熱衣原體感染所引起。本文2 例患者除有發(fā)熱、咳嗽少痰、乏力、頭痛、肌肉酸痛等癥狀外，同時(shí)伴有惡心、食欲不振的消化道癥狀。鸚鵡熱衣原體肺炎患者實(shí)驗(yàn)室檢查白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常，而中性粒細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞沉降率、C 反應(yīng)蛋白、降鈣素原增高，肺部影像學(xué)表現(xiàn)為單側(cè)肺葉大片實(shí)變影或斑片狀影，可累及多個(gè)肺葉（2 葉以上），常合并雙側(cè)胸腔積液[9-10]。2 例患者中性粒細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞沉降率、C 反應(yīng)蛋白、降鈣素原及胸CT表現(xiàn)均與上述報(bào)道相符。病例1 患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增高，可能與發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)和/或存在多種病原體感染有關(guān)。病例2 患者入院前白細(xì)胞計(jì)數(shù)稍高，但入院后復(fù)查白細(xì)胞計(jì)數(shù)在正常范圍內(nèi)，與葛玲玲等[11]報(bào)道一致。研究表明[2]，與非重癥鸚鵡熱衣原體肺炎患者比較，重癥患者降鈣素原顯著增高，且46.7%重癥患者胸CT 可見炎癥累及多個(gè)肺葉。據(jù)報(bào)道[12～14]，鸚鵡熱衣原體重癥肺炎患者可出現(xiàn)全身多器官功能衰竭、壞死性皮膚損害、敗血癥等嚴(yán)重并發(fā)癥，預(yù)后較差，故臨床醫(yī)生應(yīng)對(duì)鸚鵡熱衣原體感染提高警惕。

針對(duì)鸚鵡熱衣原體的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查包括病原學(xué)培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)或PCR 檢測(cè)。病原學(xué)培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生物安全要求高，不易培養(yǎng)；血清學(xué)檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，僅適用于回顧性診斷；PCR 檢測(cè)可檢出具體的基因分型，但僅在急性期敏感性高[15]。mNGS 可以應(yīng)用于多種標(biāo)本類型，如痰、咽拭子、血液、BALF、胸水、腦脊液、膿液、組織標(biāo)本等，直接對(duì)標(biāo)本中的核酸進(jìn)行高通量測(cè)序，通過與已知微生物序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，根據(jù)序列信息無偏倚檢測(cè)出標(biāo)本中所有微生物類型，包括病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲[16]，經(jīng)生物信息學(xué)分析后從結(jié)果中獲得與感染相關(guān)的病原微生物信息[17]。使用mNGS 技術(shù)確認(rèn)病原微生物為診斷新發(fā)、突發(fā)、罕見及常規(guī)檢測(cè)陰性的感染性疾病提供了新的選擇，是臨床實(shí)驗(yàn)室的重要技術(shù)補(bǔ)充[18]。本文病例1 患者mNGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌、鸚鵡熱衣原體、白色念珠菌、葡萄牙棒孢酵母4 種病原體，而病原體培養(yǎng)僅見銅綠假單胞菌、白色念珠菌2 種病原體。病例2 患者mNGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鸚鵡熱衣原體和人巨細(xì)胞病毒2 種病原體，而病原體培養(yǎng)無任何發(fā)現(xiàn)。與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法比較，mNGS 檢出的病原體種類更多。林明珍等[19]對(duì)87 例初治失敗的社區(qū)獲得性肺炎患者進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示mNGS 檢出的病原體陽性率高達(dá)85.06%，而傳統(tǒng)方法僅為8.05%。謝栓栓等[20]的研究結(jié)果顯示mNGS 診斷感染性疾病的敏感度（67.53%）顯著高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法（27.23%），并在檢測(cè)克雷伯桿菌、厭氧菌、假單胞菌、曲菌和結(jié)核分枝桿菌確有優(yōu)勢(shì)，與Miao 等[21]的研究結(jié)果類似。治療鸚鵡熱衣原體感染的首選藥物為四環(huán)素，大環(huán)內(nèi)酯類可作為替代藥物[22]。本文2 例患者初始抗感染治療失敗，經(jīng)mNGS 檢測(cè)明確病原體診斷后，改用多西環(huán)素治療，病情明顯好轉(zhuǎn)。陳涔等[23]的研究證明，對(duì)重癥肺炎患者BALF 行mNGS 檢測(cè)明確病原微生物后，使用針對(duì)性藥物抗感染治療效果優(yōu)于經(jīng)驗(yàn)性的“廣覆蓋”治療。

綜上，mNGS 具有檢測(cè)耗時(shí)短和靈敏度強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)明確病原體診斷和指導(dǎo)臨床用藥有重要價(jià)值，可以有效縮短病程，改善患者預(yù)后。同時(shí)，mNGS 通過測(cè)序抗生素耐藥基因，在耐藥預(yù)測(cè)方面有巨大潛力，對(duì)指導(dǎo)和改進(jìn)抗生素方案具有重要意義[24]。除呼吸系統(tǒng)感染外，mNGS 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、血液感染、胃腸道感染、眼部感染的病原體診斷中也有重要價(jià)值[25]。值得注意的是，mNGS 的檢測(cè)結(jié)果中包含大量的背景菌，尤其是口腔定植菌群會(huì)干擾致病菌的鑒別，需要臨床醫(yī)師依據(jù)檢測(cè)結(jié)果、臨床病史以及檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)來綜合做出判斷[4]。當(dāng)前，檢測(cè)費(fèi)用偏高是限制mNGS 技術(shù)進(jìn)一步推廣的主要原因，但在疑難雜癥、危重癥、免疫缺陷等特殊人群中仍具有成為病原體診斷準(zhǔn)一線檢測(cè)手段的潛力[26]。臨床醫(yī)生應(yīng)多方面綜合評(píng)估m(xù)NGS的應(yīng)用指征，以期mNGS 技術(shù)在臨床實(shí)踐中發(fā)揮更大的價(jià)值。