水貂BMP2基因克隆及序列相關(guān)分析

劉琳玲，涂劍鋒，鄭軍軍，張 如，宋姍姍，楊福合，王桂武

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是一種能誘導(dǎo)異位骨發(fā)生的糖蛋白。1965年，Urist等將去鈣骨片段植入到肌肉中誘導(dǎo)新骨生成，從骨片段中提取到的活性物質(zhì)，即骨形態(tài)發(fā)生蛋白首次被發(fā)現(xiàn)并命名；1979年，又從兔骨中分離出BMP2，BMP3和BMP7。Kulessa等研究發(fā)現(xiàn)BMP會(huì)抑制毛囊生長(zhǎng)和調(diào)控毛囊毛干分化的作用。BMP2對(duì)脂肪分化、成骨分化、軟骨生成和生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用，可以促進(jìn)骨組織和軟骨的生成，對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡有調(diào)節(jié)作用。1999年，Wilson等在毛囊毛干發(fā)現(xiàn)BMP2。研究發(fā)現(xiàn)，BMP2在老鼠的毛囊發(fā)育與生長(zhǎng)中起到重要作用。2基因在內(nèi)蒙古絨山羊絨毛脫落期次級(jí)毛囊的毛干周圍強(qiáng)烈表達(dá)，在興盛期不表達(dá)，說明參與抑制毛囊生長(zhǎng)。谷博研究發(fā)現(xiàn)2在遼寧絨山羊次級(jí)毛囊發(fā)生、變化、生長(zhǎng)和發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。

貂皮是中國(guó)東北三寶之一，素有“裘中之王”的美稱。貂皮皮板優(yōu)良，輕柔結(jié)實(shí)、毛絨豐厚、色澤光潤(rùn)。目前，貂種的退化現(xiàn)象比較嚴(yán)重，毛皮品質(zhì)變差，毛絨稀疏、針毛變長(zhǎng)，如何培育出優(yōu)質(zhì)貂皮的水貂品種為當(dāng)務(wù)之急，有必要加深對(duì)貂皮的毛絨品質(zhì)研究。叢波等研究表明，丹麥咖啡水貂針毛和絨毛都顯著長(zhǎng)于美國(guó)短毛黑水貂。本研究以短毛黑水貂和咖啡水貂為試驗(yàn)材料，采用直接測(cè)序方法分析2基因的單核苷酸多態(tài)性，并對(duì)2基因多態(tài)性與毛長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)分析，旨在尋找與毛長(zhǎng)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為進(jìn)一步研究水貂毛長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

252只7月齡雄性水貂血樣采自大連名威貂業(yè)有限公司。在水貂取皮期，心臟采血，用檸檬酸葡萄糖抗凝，-20 ℃凍存。全血基因組試劑盒提取基因組DNA，溶解于TE中， -20 ℃凍存。

1.2 試劑

全血基因組試劑盒、Marker和Taq DNA聚合酶均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

根據(jù)雪貂2基因序列(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號(hào): NW_004569172)為參考，用Primer Premier 5.0 軟件在外顯子1、2和3處各設(shè)計(jì)1對(duì)引物，由生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列、擴(kuò)增區(qū)域和產(chǎn)物大小見表1。PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體積為25 μL：上下游引物各0.25 μL，DNA模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.15 μL，10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，dd HO 18.85 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 20 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃下保存。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 PCR產(chǎn)物的測(cè)序

將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂凝膠中電泳后用膠回收試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增片段回收，送生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物序列及相關(guān)信息Table 1 The primer sequences and information

1.6 SNPs位點(diǎn)確定和基因型分析

利用DNAMAN軟件對(duì)基因進(jìn)行序列比對(duì)分析篩查SNPs位點(diǎn)。通過Chromas 5.0軟件根據(jù)測(cè)序峰圖進(jìn)行基因分型。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Popgene1. 32軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。統(tǒng)計(jì)純合度、雜合度、基因型頻率和等位基因頻率等群體遺傳參數(shù)。利用SAS9.4軟件對(duì)SNPs位點(diǎn)基因與毛長(zhǎng)表型的關(guān)聯(lián)分析，以<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMP2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

利用設(shè)計(jì)的3對(duì)引物進(jìn)行2基因擴(kuò)增，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)，BMP2-1引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為335 bp，BMP2-2引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為390 bp，BMP2-3引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 080 bp，與預(yù)期設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大小一致。

圖1 水貂BMP2基因3對(duì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-6.產(chǎn)物;a.BMP2-1；b.BMP2-2；c.BMP2-3Fig.1 Electrophoresis of the products of BMP2 gene in mink from 3 pairs of primersM. DNA Marker；1-6.The products of BMP2 gene; a.BMP2-1；b.BMP2-2；c.BMP2-3

2.2 BMP2基因外顯子的多態(tài)性檢測(cè)

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，BMP2基因的外顯子1、2、3未發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)，內(nèi)含子1發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNPs位點(diǎn)。C159T位點(diǎn)有3種基因型(圖2)：CC、TC和TT基因型。

2.3 群體遺傳參數(shù)分析

由表1可知，CC基因型為短毛黑水貂和咖啡水貂的優(yōu)勢(shì)基因型。C等位基因?yàn)槎堂谒鹾涂Х人醯膬?yōu)勢(shì)等位基因。

由表2可知，C159T位點(diǎn)在短毛黑水貂群體中為中度多態(tài)(0.05>PIC>0.25)，而在咖啡水貂群體中表現(xiàn)為低度多態(tài)(PIC<0.25)。χ2檢測(cè)結(jié)果表明，C159T位點(diǎn)在短毛黑水貂群體顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，在咖啡水貂群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

2.4 C159T位點(diǎn)與水貂毛長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

C159T位點(diǎn)形成的不同基因型在2種水貂品種中差異不顯著(>0.05)，推測(cè)該位點(diǎn)與水貂毛長(zhǎng)性狀無關(guān)聯(lián)。

2.5 序列分析

對(duì)擴(kuò)增的3個(gè)外顯子序列和已發(fā)表的雪貂(NW_004569172.1)，人(NC_000020.11)，家鼠(NC_000068.7)，牛(NC_037340.1)，豬(NC_010459.5)，狗 (NC_006606.3)，馬(NC_009165.3)，羊(NC_040264.1)9個(gè)物種的2基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和同源性比較分析。

圖2 CC、TC和TT基因型的測(cè)序峰圖Fig.2 The sequence peak graph of CC, TC and TT genotypes

表1 BMP2基因C159T位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率Table 1 Genotype frequency and allele frequencyof BMP2 C159T locus

表2 2個(gè)水貂品種C159T位點(diǎn)遺傳多態(tài)性Table 2 Genetic polymorphism of C159Tlocus in two mink breeds

表3 C159T位點(diǎn)基因型與水貂毛長(zhǎng)表型的關(guān)聯(lián)分析Table 3 Association of genotype of TC159T locus withhair length phenotype of mink

結(jié)果顯示(表4)水貂與雪貂、狗同源性最高為98.2%，93.7%，與系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果一致，水貂和雪貂親緣關(guān)系最近。

3 討 論

BMP2屬于骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族，是一種糖蛋白，包含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，其編碼區(qū)域位于外顯子2和3上。本研究發(fā)現(xiàn)不同物種間的2基因序列同源性較高。水貂與雪貂同源性最高為98.2%，且與其它哺乳動(dòng)物的同源性都在81.2%以上，說明2基因保守性很強(qiáng)。水貂和雪貂都屬于鼬科動(dòng)物，親緣關(guān)系最近。

圖3 BMP2基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig. 3 Phylogenetic tree construction of BMP2 gene

表4 BMP2基因同源性比較Table 4 Homology comparison of BMP2 gene %

BMP2是一個(gè)多功能蛋白，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)有廣泛的生物學(xué)功能。隨著近幾年對(duì)BMP2研究的越來越深入，國(guó)內(nèi)外科研人員對(duì)2基因在生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖性能、毛囊發(fā)育等的作用進(jìn)行了大量研究。Devaney等研究發(fā)現(xiàn),脂肪和肌肉質(zhì)量的差異與人類在轉(zhuǎn)錄后2基因調(diào)控元件中的功能性多態(tài)性有關(guān)。冷麗等發(fā)現(xiàn)2基因內(nèi)含子2的12 bp插入或者缺失位點(diǎn)對(duì)7周齡肉雞的股骨重、脛骨長(zhǎng)、腹脂重和腹脂率的表型變異有顯著影響。魏強(qiáng)研究表明2基因與母豬繁殖力顯著相關(guān)。BMP2是毛囊誘導(dǎo)的抑制物，在毛囊發(fā)育的休止期表達(dá)量高，對(duì)毛囊發(fā)育起到抑制作用。

本研究對(duì)2基因的3個(gè)外顯子設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，通過PCR產(chǎn)物直接測(cè)序檢測(cè)對(duì)2種水貂品種進(jìn)行了多態(tài)性分析，在外顯子2和3中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。這與以前的研究結(jié)果一致。王憑青等采用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)2基因外顯子2、3在山羊4個(gè)品種中均沒發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。鐘昕在2基因CDS區(qū)進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)。檢測(cè)2基因外顯子1、2和3的部分區(qū)域，未發(fā)現(xiàn)突變。初步推斷，2基因的外顯子1、2和3序列相對(duì)保守。說明2基因的三個(gè)外顯子區(qū)域不是影響毛長(zhǎng)的功能結(jié)構(gòu)區(qū)域，但是不排除其它區(qū)域有引起功能改變的突變位點(diǎn)，需要進(jìn)一步的研究。