精原干細(xì)胞誘導(dǎo)方法與機(jī)理研究進(jìn)展

朱大偉，白延紅，郭家俊，文成龍，楊 瑞，胡建宏*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100；2. 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

雄性生殖干細(xì)胞，即精原干細(xì)胞(Spermatogenic stem cells, SSCs)是雄性哺乳動(dòng)物體內(nèi)僅有的一種能將遺傳信息傳遞給后代的二倍體細(xì)胞，定位于曲細(xì)精管的基底膜部位。目前關(guān)于SSCs的研究已從嚙齒類(lèi)動(dòng)物逐漸發(fā)展到牛、羊等大型家畜和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，研究?jī)?nèi)容也涉及分離、純化、體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化等多個(gè)方面。本文參考目前對(duì)SSCs誘導(dǎo)分化的研究，對(duì)SSCs誘導(dǎo)分化的方法和機(jī)理進(jìn)行綜述，以期為雄性動(dòng)物輔助生殖和畜牧業(yè)生產(chǎn)方面的研究提供參考。

1 SSCs的生物學(xué)特性

SSCs定植于曲細(xì)精管的基底部，為圓形或卵圓形，細(xì)胞器除核糖體和線粒體外都不發(fā)達(dá)。SSCs核內(nèi)染色質(zhì)含量豐富且均勻，胞質(zhì)分裂不完全，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，染色質(zhì)呈深藍(lán)或藍(lán)紫色，胞質(zhì)呈淺藍(lán)色。SSCs生存所需的微環(huán)境主要由睪丸支持細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞維持，若SSCs脫離該微環(huán)境將失去其生物學(xué)特性。SSCs擁有增殖、分化和自我更新的潛能。對(duì)小鼠而言，精原細(xì)胞可分為三類(lèi)，即A型、中間型和B型，而A型精原細(xì)胞按照形態(tài)不同又可劃分成Asingle(As)型、Apaired(Apr)型、Aaligned(Aal)型、以及A1～A4型，其中前三種屬于未分化型，一般認(rèn)為As型精原細(xì)胞是SSCs，在睪丸中僅占生殖細(xì)胞總數(shù)的0.02%～0.03%。然而隨著組織移植技術(shù)的研究，發(fā)現(xiàn)As型精原細(xì)胞中真正具有增殖和分化潛能的只有10%左右，而Apr型和Aal型精原細(xì)胞中的一部分也具有自我更新的潛能。

2 SSCs的檢測(cè)與鑒定

SSCs數(shù)量極少，僅占睪丸中生殖細(xì)胞總數(shù)的0.02%～0.03%左右，因此對(duì)SSCs的檢測(cè)與鑒定成為影響SSCs分離與純化效率的重要因素。目前已發(fā)現(xiàn)且較為公認(rèn)的可作為SSCs特異性標(biāo)志物的有GFRα1、PLZF、CDH1等。謝靜靜等使用差異貼壁純化法對(duì)獲得的綿羊生殖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后將未貼壁的細(xì)胞取出以PLZF作為SSCs特異性標(biāo)記進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示存在PLZF陽(yáng)性。陳鑫蘋(píng)等采集年齡為2歲14 d的食蟹猴的單側(cè)睪丸，經(jīng)過(guò)三步酶消化法和差異貼壁法富集SSCs，經(jīng)過(guò)20 d的培養(yǎng)后進(jìn)行CDH1標(biāo)記分子免疫熒光染色和RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果均顯示為陽(yáng)性。

3 SSCs的誘導(dǎo)分化方法

不同種類(lèi)動(dòng)物SSCs分化為精子所需的條件不盡相同，SSCs體外增殖所必要的因子及培養(yǎng)條件尚待完善，因此目前除了嚙齒動(dòng)物外，大多數(shù)哺乳動(dòng)物并未建立長(zhǎng)久的SSCs體外培養(yǎng)體系?，F(xiàn)今SSCs主要有兩種定向誘導(dǎo)分化的方法：一是試劑誘導(dǎo)，即在培養(yǎng)基中加入各種定向分化所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素等，人工創(chuàng)造SSCs分化條件，例如視黃酸(retinoic acid, RA)對(duì)于維持雄性個(gè)體精子發(fā)生具有重要作用，而維生素A的活性代謝產(chǎn)物就是RA，在培養(yǎng)液中添加維生素可起到促進(jìn)精原細(xì)胞分化的作用。Wang等分別使用1 nM、10 nM、100 nM和1 uM的RA處理小鼠精原干細(xì)胞0、12、24、36 h并通過(guò)RNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)參與精原細(xì)胞分化或減數(shù)分裂的相關(guān)基因8、-的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)100 nM和24 h的處理效果最好，且誘導(dǎo)3 d后能漸進(jìn)性的誘導(dǎo)出細(xì)線期的精母細(xì)胞；李金梅等發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物的精原干細(xì)胞中不存在雄激素受體(androgen receptor,AR)，但是支持細(xì)胞中存在AR，通過(guò)向精原干細(xì)胞-支持細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系中添加二氫睪酮或雄激素拮抗劑，16 h后進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雄激素拮抗劑的處理組中AR和Wt-1表達(dá)明顯降低而Plzf表達(dá)升高，而向6周齡的小鼠腹腔注射20 mg/kg劑量的雄激素拮抗劑后發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸中精母細(xì)胞和精子的數(shù)量顯著降低而Plzf陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加,這些結(jié)果表明雄激素能夠通過(guò)間接調(diào)控精原細(xì)胞的PLZF、Wt-1通路控制精原細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程；Fahar等研究發(fā)現(xiàn)將從2～12歲的青春期前男孩體內(nèi)獲取的1 mm凍融睪丸碎片放在加入補(bǔ)充了5 IU/L FSH的KSR培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 d后能得到圓形精子細(xì)胞，而當(dāng)FSH濃度增加到50 IU/L時(shí)無(wú)法誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的分化。二是通過(guò)移植或基因修飾誘導(dǎo)，將分離、純化后的SSCs移植入受體動(dòng)物的生精小管內(nèi)，繼續(xù)增殖分化，又包括同基因移植和異基因移植兩種方式，同基因移植是指將自身的SSCs重新移植入自身睪丸內(nèi)，異基因移植是指將SSCs在同種動(dòng)物的不同個(gè)體間移植。Shetty等從3只青春期和一只青春期前的恒河猴的睪丸薄壁組織中回收到生殖細(xì)胞，經(jīng)過(guò)特殊處理后，將從青春期恒河猴睪丸中獲取的細(xì)胞混合后均勻分配給受體恒河猴，將從青春期前恒河猴睪丸中獲得的生殖細(xì)胞分配給對(duì)照組恒河猴，采用超聲引導(dǎo)法將生殖細(xì)胞注射入生殖干細(xì)胞功能受損的受體恒河猴睪丸網(wǎng)，移植后20～38周后，部分接受移植的恒河猴精液中有精子出現(xiàn)。田稼等將體外培養(yǎng)的小鼠SSCs進(jìn)行GFP+慢病毒轉(zhuǎn)染，待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)GFP蛋白后將其移植入異體小鼠的曲細(xì)精管中，3周后對(duì)受體小鼠的睪丸組織切片進(jìn)行免疫熒光染色，能觀察到顯示綠色熒光的GFPSSCs定植于曲細(xì)精管基底部，10周后在曲細(xì)精管腔內(nèi)能觀察到顯示GFP的生精細(xì)胞和成熟精子。

4 SSCs的分化機(jī)理

SSCs的分化受多種細(xì)胞因子的協(xié)調(diào)作用，在SSCs的分化過(guò)程中有3個(gè)重要的過(guò)程：As型精原細(xì)胞分化為Apr型精原細(xì)胞、Aal型精原細(xì)胞分化為A1型精原細(xì)胞以及A1型精原細(xì)胞分化為B型精原細(xì)胞，之后B型精原細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂最終形成成熟的精子細(xì)胞。

4.1 細(xì)胞因子調(diào)控機(jī)制

視黃酸(RA)是由支持細(xì)胞和生精細(xì)胞產(chǎn)生，能夠在精原細(xì)胞的分化和減數(shù)分裂中起調(diào)控作用的細(xì)胞因子。RA通過(guò)與細(xì)胞核內(nèi)不同的受體相結(jié)合，可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄變化，如減數(shù)分裂相關(guān)基因8和4的表達(dá)量增加。RA/Stra8通路在精子發(fā)生過(guò)程中起到兩種不同的作用，一是促進(jìn)精原細(xì)胞開(kāi)始分化，二是促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂狀態(tài)。謝慧等研究表明，使用RA處理小鼠SSCs能夠通過(guò)降低與甲基化相關(guān)基因1和3的表達(dá)量來(lái)促進(jìn)SSCs進(jìn)入分化過(guò)程；而來(lái)自精原細(xì)胞分泌的RA可通過(guò)自分泌方式調(diào)控Stra8直接介導(dǎo)減數(shù)分裂的開(kāi)始。Busada等研究發(fā)現(xiàn)，RA能作用于PI3K/Akt/ mTOR 信號(hào)通路進(jìn)而影響SSC分化中的關(guān)鍵基因-基因的mRNA的翻譯水平；同時(shí)當(dāng)使用雷帕霉素阻斷該信號(hào)通路后，RA介導(dǎo)的基因mRNA的翻譯受阻，可導(dǎo)致精原細(xì)胞分化障礙。Yang等研究表明，支持細(xì)胞還能通過(guò)分泌骨形成蛋白 4(BMP4)參與對(duì)精原細(xì)胞分化的調(diào)控過(guò)程，BMPR1A 和 BMP Ⅱ是蘇氨酸/色氨酸激酶受體，主要在不同時(shí)期精原細(xì)胞上表達(dá)，BMP4通過(guò)與BMPR1A和BMP Ⅱ結(jié)合可參與精原細(xì)胞的分化調(diào)控過(guò)程。BMP4還能通過(guò)協(xié)同作用與RA一起影響8和的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)精原細(xì)胞的分化。

此外，由支持細(xì)胞產(chǎn)生的干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)也能與產(chǎn)生作用，共同控制精原細(xì)胞的分化和減數(shù)分裂過(guò)程。對(duì)小鼠而言，如果基因表達(dá)發(fā)生障礙，會(huì)引起精原細(xì)胞分化受阻，睪丸中僅含有As型、Apr型和Aal型等原始精原細(xì)胞，而重組SCF后可重新恢復(fù)正常的分化過(guò)程。

4.2 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制

Stat3是一種存在于精原細(xì)胞中的重要的調(diào)控自我更新和分化的因子，Stat3受到抑制后，SSCs的分化產(chǎn)生障礙，引起未分化SSCs堆積。目前關(guān)于Stat3的作用機(jī)理并不是很明確，僅有研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)于精原細(xì)胞中的神經(jīng)原素3(3)是它的一個(gè)重要靶點(diǎn)，在睪丸中Ngn3的表達(dá)水平隨著精原細(xì)胞的分化而增加，Stat3通過(guò)與3基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子相結(jié)合增強(qiáng)其表達(dá)，高度表達(dá)的Ngn3能增強(qiáng)Stra8和SSCs分化標(biāo)志物CD117的表達(dá)量，而抑制促增殖因子-早幼粒鋅指基因()的表達(dá)，從而加速精子發(fā)生和減數(shù)分裂過(guò)程；此外維持SSCs未分化狀態(tài)的必需物GDNF能通過(guò)抑制3的磷酸化進(jìn)而抑制3的表達(dá)水平，這可能意味著Stat3/Ngn3通路對(duì)SSCs的分化具有重要作用。

Sohlh1/2是特異性表達(dá)于生精細(xì)胞中的bHLH家族成員，Sohlh1和Sohlh2間既具有相互調(diào)節(jié)作用又有協(xié)同作用。Sohlh1和Sohlh2能夠直接結(jié)合在精原細(xì)胞基因的啟動(dòng)子區(qū)并使其表達(dá)量上調(diào)，進(jìn)而激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)SSCs的分化；12單敲除或雙敲除的小鼠中，精原細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常，且未分化的A型精原細(xì)胞將不能分化為陽(yáng)性精原細(xì)胞，但是一部分精原細(xì)胞可能會(huì)過(guò)早的進(jìn)行減數(shù)分裂，這可能是因?yàn)?2的缺失會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞中Stra8表達(dá)量增加。

4.3 miRNA的調(diào)控機(jī)制

微小RNA(microRNA, miRNA)是一種對(duì)內(nèi)源性基因具有調(diào)節(jié)作用的非編碼小RNA，依靠降解靶基因或抑制靶基因的表達(dá)而發(fā)揮其調(diào)控功能，miRNA對(duì)正常精子的發(fā)生具有重要作用。miRNA-202高度表達(dá)于SSCs中，且接受RA和GDNF的反向調(diào)控。Chen等的研究發(fā)現(xiàn)，使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除miRNA-202后SSCs數(shù)量與對(duì)照組相比減少了60%，出現(xiàn)凋亡增加和過(guò)早分化現(xiàn)象，而miRNA-202的靶基因2對(duì)減數(shù)分裂的啟動(dòng)具有重要作用，說(shuō)明miRNA-202對(duì)SSCs的分化具有重要調(diào)控作用。Niu等發(fā)現(xiàn)miRNA204在49陰性的細(xì)胞中表達(dá)量較高，能直接作用1基因且抑制其表達(dá)，而被抑制的Sirt1會(huì)導(dǎo)致與SSCs自我更新和增殖相關(guān)的基因如、4的表達(dá)量下降，最終促進(jìn)SSCs的分化。Cui等通過(guò)RT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-224是一種高度表達(dá)于小鼠SSCs中的表觀調(diào)控因子，當(dāng)使用陰性對(duì)照小RNA、miRNA-224抑制劑和miRNA-224對(duì)照分別轉(zhuǎn)染小鼠SSCs時(shí)發(fā)現(xiàn)miRNA-224對(duì)照能顯著增加SSCs的數(shù)量以及SSCs中的1和的mRNA和蛋白水平，而miRNA-224抑制劑會(huì)減少SSCs的數(shù)量同時(shí)降低1和的表達(dá)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)miRNA-224能通過(guò)靶向其3'-UTR直接降低1的水平，而之后的1敲除實(shí)驗(yàn)顯示β-catenin的表達(dá)水平會(huì)顯著提高，這些結(jié)果表明miRNA-224對(duì)SSCs的增殖和分化具有重要調(diào)控作用且能夠通過(guò)Wnt/β-catenin 通路來(lái)促進(jìn)精原細(xì)胞分化。王銀娟等發(fā)現(xiàn)miRNA-322在SSCs的表達(dá)量隨著SSCs的發(fā)育而降低，體外增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA-322被抑制的SSCs中與分化有關(guān)的基因如8和等表達(dá)量上調(diào)，而SSCs本身的增殖能力受到抑制；當(dāng)使用氯化鋰處理SSCs后發(fā)現(xiàn)miRNA-322表達(dá)量被上調(diào)，同時(shí)Rassf8被下調(diào)，而miRNA-322的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致Wnt通路中下游基因表達(dá)下調(diào)，之后用檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)發(fā)現(xiàn)miRNA-322的表達(dá)會(huì)使增加S期和G2/M期的比例，說(shuō)明miRNA-322對(duì)SSCs的增殖和分化具有重要調(diào)控作用。

圖1 成年小鼠SSCs的調(diào)控[18]Fig.1 Regulation of adult mouse SSCs[18]

5 SSCs的應(yīng)用

SSCs作為雄性生殖干細(xì)胞能通過(guò)增殖、分化不斷產(chǎn)生精子，對(duì)SSCs的研究能對(duì)精子發(fā)生機(jī)理、治療雄性動(dòng)物不育以及畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展方面都具有重要作用。Zarandi等研究表明在癌癥治療前，對(duì)癌癥患者的睪丸組織進(jìn)行分離保存，等治愈后再將睪丸中的SSCs進(jìn)行體外擴(kuò)增并重新移植入患者體內(nèi)，可以有效保存癌癥患者的生育力。通過(guò)將優(yōu)良種畜的SSCs移植入經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低的公畜睪丸中，能有效提高優(yōu)良品種的繁殖效率。此外SSCs還能通過(guò)去分化和轉(zhuǎn)分化的作用生產(chǎn)其他類(lèi)型的細(xì)胞，目前已有研究證明SSCs能直接轉(zhuǎn)分化為功能性肝細(xì)胞。

6 小 結(jié)

隨著精原干細(xì)胞深入研究，人們對(duì)精子發(fā)生過(guò)程的研究取得了一定的進(jìn)展，對(duì)小鼠等小型動(dòng)物SSCs的體外培養(yǎng)體系已經(jīng)初步建立，但是對(duì)哺乳動(dòng)物等大動(dòng)物方面仍存在較多問(wèn)題，如對(duì)SSCs分離純化時(shí)樣本獲取困難同時(shí)缺乏特異性分子標(biāo)記使分離純化效率較低；對(duì)不同動(dòng)物SSCs的分離純化技術(shù)不同，但都操作復(fù)雜，成本較高；對(duì)SSCs體外培養(yǎng)體系中維持其增殖以及干細(xì)胞特性所需物質(zhì)尚不明確，使SSCs難以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)及傳代，給研究增加了難度；對(duì)SSCs誘導(dǎo)分化的機(jī)理不是很清楚，因此在后續(xù)研究中建立各種動(dòng)物高效且簡(jiǎn)便的SSCs分離、純化方法；進(jìn)一步探索體外培養(yǎng)體系中所需具體物質(zhì)解決體外長(zhǎng)期培養(yǎng)及傳代的穩(wěn)定性問(wèn)題；探索SSCs體外誘導(dǎo)分化方法，為SSCs的移植提供材料，同時(shí)克服SSCs移植過(guò)程中免疫排斥問(wèn)題，提高移植成功率將成為研究重點(diǎn)。