PCR技術在食品微生物檢測中的應用價值

張譯芳 王圣瑜

本文主要探究PCR技術在食品微生物檢測中的應用價值，以期能夠為相關從業(yè)人員提供可借鑒的經(jīng)驗。首先闡述PCR技術的主要內(nèi)涵和類型，并對PCR技術的具體應用方法進行總結，然后通過多重串聯(lián)式實時熒光定量PCR檢測方法，對樣品基因組DNA進行提取，從而分析食品微生物情況。試驗證明，PCR技術在食品微生物檢驗中具有良好的應用效果。

一、PCR技術的基本概述

PCR技術是指聚合反應鏈技術，利用模板在核苷酸底物和DNA聚合酶的共同作用下，擴增DNA數(shù)量，在食品安全檢測中可以測定食品過敏源、食源微生物、乳品企業(yè)的阪崎腸桿菌等，應用前景十分廣闊。具體而言，PCR技術可以分為常規(guī)PCR技術、實時熒光定量PCR技術和數(shù)字PCR技術這三種類型。

1.常規(guī)PCR技術。通過退火、變性、延伸，復制子鏈DNA，快速實現(xiàn)體外擴增的目的，儀器試劑成本較低。

2.熒光定量PCR技術。作為當前應用最廣泛的食品微生物檢測技術之一，熒光定量PCR技術是一種在DNA擴增反應中通過熒光化學物質(zhì)測得每次聚合酶鏈式反應循環(huán)后產(chǎn)生總量的方法，利用內(nèi)參或外參方法對待測樣品中的DNA序列進行定量分析，通過熒光信號對PCR進程實時檢測。在PCR擴增指數(shù)過程中，模板CT值與該模板的起始復制數(shù)存在線性關系，所以可以作為定量依據(jù)，并且此法較為成熟，操作簡單，試劑成本中等，配套儀器和試劑均較為齊全，特異性也較強。

3.數(shù)字PCR技術。數(shù)字PCR技術可以直接讀取DNA分子個數(shù)，是一種核酸分子絕對定量計數(shù)，利用專業(yè)檢測設備（比如QX100dPCR），可以將擴增后的芯片轉移至微滴閱讀分析系統(tǒng)，之后讀取熒光信號。整個過程在封閉的芯片中運行，操作較為復雜，但是污染的風險性較低，通過評估數(shù)字PCR平臺以及平臺之間相互驗證，可以使測定結果更加精準。

二、PCR技術在食品微生物檢測中的具體應用

在食品微生物檢測中，PCR技術主要是利用微生物分子檢測儀，對有害微生物的核酸進行提取，然后構建熒光定量PCR體系，通過多重串聯(lián)式實時熒光定量PCR檢測方法，對樣品基因組DNA進行提取，從而分析食品微生物情況。具體應用方法如下：

1.選定檢測儀器。在進行微生物檢測之前，要選擇合適的檢測儀器，本文主要以CSY-ATP檢測儀為例。CSY-ATP檢測儀能夠對水中微生物、食品中微生物、餐飲器具等進行快速檢測，利用生物化學方法來檢驗ATP菌落總數(shù)，其檢測精度為1*10-16molestp，檢測范圍為1-9999PLUS，重復性≤5%。由于含有高靈敏度光度計，此檢測方法較為便捷，不需要復雜的前期處理。利用微生物分子檢測儀，可以測試果汁、豆?jié){、雞肉、牛奶、面包、水產(chǎn)品等樣本中的微生物含量;利用多孔板可以完成多次試驗，檢測出食品中含有的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌、單核細胞增生李斯特氏菌等多種食源性疾病的主流微生物。技術人員也可以構建多重串聯(lián)式實時熒光定量PCR檢測方法，但是應用到的主要儀器設備除了CSY-ATP檢測儀，還包括多重PCR試劑盒、立式壓力蒸汽滅菌器、冰箱、凝膠成像儀、核酸電泳儀、梯度PCR儀、超微量分光光度計、光學顯微鏡等，檢驗過程需要在全封閉情況下進行，防止出現(xiàn)假陰性和假陽性情況，從而提高檢測質(zhì)量和準確性。

2.試驗與檢測方法。（1）配置試劑。①BHI肉湯：取雞肉或者豬肉作為樣本，稱取38.5g，放置在1000mL蒸餾水中，加熱攪拌使其溶解，在121℃高壓環(huán)境下滅菌，滅菌時間為15-18min。②0.5*TBE：用滅菌純水稀釋50mL的10*TBE，放置在25℃環(huán)境中保存。③10*TBE：將108g的Ttis、55g的硼酸、0.5M的Na2EDTA（40mL）混入800mL蒸餾水中，對pH值進行調(diào)整，確保pH值能夠穩(wěn)定在7.8-8.0范圍內(nèi)，然后放置在高壓滅菌室中保存。④2%瓊脂糖凝膠：稱取定量瓊脂糖，每份0.9g，加入0.5*TBE，用量為30mL，放置于藍蓋瓶中，用微波爐加熱1min，待瓊脂糖全部溶解后，取出倒入模具冷卻。⑤BHI瓊脂：稱取瓊脂糖40g，將其溶解之后放入蒸餾水中分裝，蒸餾水含量為1000mL，之后放入121℃高溫環(huán)境下進行滅菌，滅菌時間設定為15-18min。

（2）構建PCR檢測體系。對需要檢測的靶基因進行擴增，將目標菌種制成模板，混合液含有每個菌種20ng，其多重PCR反應體系和PCR反應程序如表1所示。

在多重PCR反應體系和PCR反應程序構建完成之后，按照測定結果繪制標準曲線，得到擴增效率。根據(jù)稀釋倍數(shù)的不同，確定菌落計數(shù)結果。每隔12h進行三重PCR檢測，如果變異系數(shù)均維持在1.3%-3.9%，說明所采用的測試方法重復性良好，具有良好的精準性。

（3）試驗操作。以PCR技術在檢測牛奶中沙門氏菌含量的研究作為試驗案例，選擇合適的PCR模板制備方法，之后進行靈敏度試驗，得出檢測試樣中沙門氏菌的敏感性。具體操作方法如下：

①樣品選擇和純菌培養(yǎng)。選擇市場中的普通牛奶產(chǎn)品（盒裝，每盒250mL），經(jīng)過高壓蒸汽滅菌處理后放置在冰箱中保存，冷藏溫度保持在4℃-5℃，全部試驗菌株接種5mL液體，液體培養(yǎng)需要震蕩，培養(yǎng)基為LB，培養(yǎng)溫度為37℃-38℃，震蕩速率為220r/min。采用乙醇沉淀法制備PCR模板，提取1mL細菌培養(yǎng)液離心2min，轉速為12000r/min，置于小離心管中;采用滅菌蒸餾水洗滌，利用懸浮液緩沖，懸浮液為300μL，之后在8000r/min的環(huán)境下離心20min，隔水煮沸15min;加入40μL醋酸鈉，pH值為5.4;加入無水乙醇80μL，在12000r/min的環(huán)境下離心20min，利用50μL的TE緩沖劑復溶;利用70%乙醇進行洗滌，放入4℃冰箱中冷卻之后取出，即為模板。

②檢測結果分析。以上述試驗流程得到的樣品DNA為模板，將具有一定濃度的菌液接種到試驗樣本中，提取樣本中的基因組DNA，對擴增CT值進行繪圖，檢測MT-PCR。依據(jù)MT-PCR標準曲線，測定樣本中MT-PCR的檢測下限，其中阪崎腸桿菌的檢測下限為103LOD（CFU/g）、大腸埃希菌的檢測下限為103LOD（CFU/g）、蠟樣芽孢桿菌的檢測下限為103LOD（CFU/g）、金黃色葡萄球菌的檢測下限為103LOD（CFU/g）、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測下限為102LOD（CFU/g）、福氏志賀氏菌的檢測下限為103LOD（CFU/g）。觀察R2值，若R2值符合標準值規(guī)定，說明樣品微生物檢測合格;若超過標準值，則說明樣品微生物檢測不合格，樣品中存在微生物超標問題，不符合食品安全條例，這種食品如果被消費者食用，會給消費者的身體健康造成一定影響。

三、PCR技術在食品微生物檢測中的應用價值

沙門氏菌是引起食源感染性腹瀉的致病微生物之一，其菌型繁多，嚴重威脅消費者的安全和健康。傳統(tǒng)的檢測方法更依賴于微生物檢測法或免疫熒光試驗法，但卻費時費力，并且可能存在假陽性、假陰性問題，不適于常規(guī)檢查，如果利用PCR擴增技術則可以提高檢測的準確性。

隨著科學技術的發(fā)展，PCR技術已經(jīng)成為分子檢測領域的佼佼者，不僅在病源體檢測方面具有一定的優(yōu)勢，在病源微生物檢測方面的靈敏性也更高，對各種類型都可以進行檢測，大大縮短了報告周期，與傳統(tǒng)檢測方法相比，操作更為簡單。

由于不同微生物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)、溫濕度、pH值均有不同，在微生物檢測中需要耗費大量的人力和物力去觀察革蘭氏染色情況、菌落特征和細胞特征，自動化程度不高，無法滿足現(xiàn)代食品微生物檢測的需要。而利用PCR技術可以由一個人完成檢測過程，一天就可以得出結果，還可以同時檢測多種病原微生物，而傳統(tǒng)微生物檢測方法至少需要七天。

除了在牛奶中檢測沙門氏菌，技術人員也可以按照相應的標準和操作流程，對其他微生物菌落進行檢驗，將其他菌體接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)，然后測定PCR技術在食品微生物檢測方面的有效性，測定樣品的偏差值。比如，將市面上某家超市中采集的牛奶、醬油、面包、雞肉、飲料作為樣本，測定其菌體含量，具體數(shù)據(jù)如表2所示。

通過表2的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，采用PCR技術測定食品微生物含量，能夠得到各種菌落的實際情況。例如，在牛奶檢測過程中，其沙門氏菌的標準值為23.11%，金黃色葡萄球菌的標準值為20.80%，但在檢測過程中，只有樣品1和樣品2的沙門氏菌含量在標準值之內(nèi)，而樣品3的沙門氏菌含量高于標準值，同時只有樣品1的金黃色葡萄球菌在標準值范圍之內(nèi)，樣品2和樣品3的金黃色葡萄球菌均超于標準值。因此，若只將沙門氏菌和金黃色葡萄球菌兩項微生物作為檢驗標準，僅有樣品1符合食品安全規(guī)定。以此類推，可以判定食物微生物是否超標，也可以證明PCR技術能夠更加方便、快捷、迅速地得出檢驗結論，提高檢測質(zhì)量和準確性。348D1141-19FB-420F-9ED2-A08157F8BE63