不同底質(zhì)及光照條件對輪葉黑藻組織培養(yǎng)及種植的影響

呂 喆，劉 杰，張靖華，萬 云，冷 欣

(1.南京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南京 210023；2.安徽建筑大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，合肥 230601)

沉水植物作為水生態(tài)系統(tǒng)的重要生產(chǎn)者，具有重要的生態(tài)學(xué)功能與意義。已有研究發(fā)現(xiàn)，沉水植物能有效吸收儲存水環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，影響水域中的物質(zhì)循環(huán)[1-2]；緩解水體富營養(yǎng)化，抑制浮游植物生長，減少藻類大暴發(fā)，為其他水生植物的生存和生長提供條件[3-4]；還能有效富集重金屬及懸浮顆粒[5]；從而支撐整個水域的生物群落和食物鏈。大量研究表明，恢復(fù)重建沉水植物，可改善水質(zhì)，提高生態(tài)多樣性。

輪葉黑藻(Hydrillaverticillate)是水鱉科(Hydrocharitaceae)的一種多年生沉水植物，普遍生長于世界各處水域中，具有極強的耐污性，同時自身的凈化能力又使其成為水生植物恢復(fù)過程中的先鋒物種[6]。眾所周知，植物組織培養(yǎng)作為一項被廣泛使用的技術(shù)，能夠不受時間和空間的限制，通過篩選優(yōu)質(zhì)種苗，快速產(chǎn)出大量同樣高品質(zhì)的種苗，目前國內(nèi)已有輪葉黑藻組培的相關(guān)方法，從培養(yǎng)基配比、外植體處理、芽誘導(dǎo)增殖及馴化等方面進行了系統(tǒng)的研究，當下的培養(yǎng)方法是使用MS培養(yǎng)基，置于光照度為1 000 lx的白光下，每天照射10 h[7]。而光照這一關(guān)鍵環(huán)境因素可分為光強、光質(zhì)和光周期3個方面，對植物的組織分化、生長發(fā)育、形態(tài)構(gòu)成、物質(zhì)積累等有重要影響。

本實驗設(shè)置不同光質(zhì)和光周期進行輪葉黑藻的組織培養(yǎng)，探究不同光照條件對輪葉黑藻組織培養(yǎng)的影響，尋找最適培養(yǎng)光照條件。為了驗證培養(yǎng)出的輪葉黑藻種苗質(zhì)量，使其能夠在環(huán)境各異的河流湖泊中因地制宜地種植，還設(shè)置不同的遮光程度模擬不同水深，搭配不同的底質(zhì)類型探討其對輪葉黑藻生長的影響。針對研究中關(guān)于底質(zhì)和水深對植物生長影響結(jié)論不一[8]，本文通過探究輪葉黑藻組培苗在不同底質(zhì)與水深下生長表現(xiàn)，探尋不同條件下的最佳種植方式。

1 材料與方法

1.1 材料

為探究光質(zhì)及光周期對輪葉黑藻組織培養(yǎng)的影響，選用在實驗室中繼代培養(yǎng)一年的成熟健壯輪葉黑藻作為母本，在超凈工作臺上剪取健壯的片段置于盛有MS培養(yǎng)液的錐形瓶內(nèi)，封上封口膜后置于組培室培養(yǎng)，光照周期8 h/d，室內(nèi)溫度(25±1)℃,培養(yǎng)期間隨時剔除污染以及長勢不佳的植株，培養(yǎng)一個月后的植株留作本次實驗的種苗。

為探究底質(zhì)類型和遮光程度對輪葉黑藻組培苗野外生長的影響，選取在實驗室中同批培養(yǎng)的成熟健壯組培苗剪為長(2±0.2)cm，重(0.2±0.01)g的片段，置于營養(yǎng)液中備用。泥土和沙子均取自常熟市南湖濕地公園，種植用水是南湖水，水質(zhì)指標為氨氮0.05 mg/L，總氮1.1 mg/L，COD 17 mg/L，總磷0.25 mg/L。

1.2 方法

為探究光質(zhì)及光周期對輪葉黑藻組織培養(yǎng)的影響，采用雙因素交叉設(shè)計，設(shè)置白光(W)、紅光(R)、藍光(B)、紅藍1∶1混合光(R&B)4種光質(zhì)(白光為全光譜，紅光波長658 nm，藍光波長444 nm)，8 h光照/16 h黑暗、12 h光照/12 h黑暗、16 h光照/8 h黑暗3種光照周期(以下簡稱8 h/d、12 h/d、16 h/d)，共計12種光照處理，設(shè)置光量子通量均為50 μmol/m2·s；在無菌條件下將種苗植株均勻剪為2 cm左右的片段，每個片段上帶有6片左右的葉片，每瓶培養(yǎng)液中接入一個片段，置于不同的光照處理下培養(yǎng)。

為探究底質(zhì)類型和遮光程度對輪葉黑藻組培苗種植的影響，設(shè)置泥土、沙子、泥沙混合(1∶1)3種底質(zhì)類型，裝入一次性種植袋中，底質(zhì)厚度10 cm，每個種植袋中種入3株輪葉黑藻組培苗片段，用遮陽網(wǎng)設(shè)置不遮光、40%遮光和80%遮光，共計9種條件，每種條件設(shè)置27組重復(fù)，分別置于3個1 m×1 m×1 m的大水箱中，水深保持1 m，每隔10天換水一次。

1.3 測定指標及方法

從培養(yǎng)的第15天起，每隔10 d每種處理隨機選取兩瓶組培苗，一瓶記錄莖長后在烘箱內(nèi)80 ℃烘至恒重，測定干重；一瓶采用比色法測定葉綠素含量，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。至第55天時，多選取兩瓶組培苗，一瓶采用蒽酮法測定植物可溶性總糖含量，采用考馬斯亮藍比色法測定植物可溶性蛋白含量；一瓶使用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒測定SOD、POD、CAT活性及MDA含量。酶活力單位定義如下：SOD：在黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中樣本的抑制百分率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位；POD：每g組織在每mL 反應(yīng)體系中每分鐘470 nm下吸光值變化0.01定義為一個酶活力單位；CAT：每g組織每分鐘催化1 μmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。

從種植的第10天起，每隔10 d每種處理隨機取出9個種植袋，每袋中隨機選取一株輪葉黑藻測量其株高、根數(shù)、芽數(shù)，而后分成根、莖、葉置于烘箱中80 ℃烘至恒重，并計算根、莖、葉的干重占比，至第30天共計3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用SPSS、R語言等統(tǒng)計軟件進行雙因素協(xié)方差分析和Bonferroni多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 光質(zhì)及光周期對輪葉黑藻組織培養(yǎng)的影響

2.1.1 光質(zhì)和光周期對輪葉黑藻組培苗干重和莖長的影響

在培養(yǎng)前期(15 d和25 d)生長速度緩慢，人工接種初始片段的誤差對干重結(jié)果干擾嚴重，從第35天開始趨向正常，故在干重分析中15 d和25 d數(shù)據(jù)不納入分析。從第35天開始，表示紅光的紅色散點和表示12 h/d光照周期的三角形散點處于頂部位置，表明其干重較大；同樣，表示藍光的藍色散點和表示8 h/d光照周期的圓形散點基本位于底部，表明其干重較小(圖1)。

圖1 光照條件對輪葉黑藻組培苗干重對數(shù)的影響

為滿足正態(tài)性和方差齊性的要求，對干重進行以10為底的對數(shù)變換。根據(jù)方差分析結(jié)果可知：輪葉黑藻組培苗干重在不同光質(zhì)及光周期下有顯著性差異(P<0.01)；莖長受光周期影響極顯著(P<0.01)，而受光質(zhì)影響不顯著，光質(zhì)和光周期的協(xié)同作用影響不顯著(表1)。

表1 不同光照條件下輪葉黑藻組培苗干重和莖長的方差分析結(jié)果

紅光處理下輪葉黑藻的干重均顯著大于其他光質(zhì)，其他光質(zhì)之間沒有差異；光周期對干重的影響在不同時間、不同光質(zhì)下表現(xiàn)不一，在第35天，干重在白光和紅光下為12 h/d>16 h/d>8 h/d，在藍光和紅藍混合光下則為16 h/d>12 h/d>8 h/d；在第45天，白光、紅光和藍光下12 h/d的干重顯著高于其他兩組，紅藍混合光下3種光周期之間沒有顯著差異；在第55天，白光下12 h/d的干重大于其他兩組，藍光下3種光周期之間沒有顯著差異，紅光和紅藍混合光下12 h/d和16 h/d之間沒有差異，均遠大于8 h/d(圖2)。

不同字母表示存在顯著差異，顯著水平(P<0.05)。

12 h/d光周期下輪葉黑藻莖長要顯著大于其他兩組，在第15天到第45天，8 h/d和16 h/d光周期下莖長沒有顯著差異，但16 h/d光周期呈現(xiàn)反超8 h/d的趨勢，至第55天，16 h/d光周期下莖長顯著大于8 h/d(圖3)。

2.1.2 光質(zhì)和光周期對輪葉黑藻組培苗葉綠素含量的影響

方差分析結(jié)果顯示，光質(zhì)和光周期均顯著影響葉綠素a和葉綠素b的含量；而光質(zhì)和光周期及其交互作用顯著影響了葉綠素a和葉綠素b的比值。輪葉黑藻組培苗葉綠素含量在不同光照條件下的差異主要是由光周期引起的(表2)。

12 h/d光周期下葉綠素a、葉綠素b的含量遠高于其他兩組。對于葉綠素a來說，從第35天開始，藍光下的葉綠素a含量均最高，而光周期則基本呈現(xiàn)12 h/d>8 h/d>16 h/d；而對于葉綠素b來說，在第15天到第35天，白光照射下含量高于其他光照，而從第45天開始各組光質(zhì)之間均沒有顯著差異，8 h/d和16 h/d光周期下，葉綠素b含量無顯著差異。藍光照射下葉綠素a/b最大，紅藍混合光次之；對于光周期而言，12 h/d的葉綠素a/b最低，而8 h/d和16 h/d的葉綠素a/b沒有顯著性差異(圖4)。

(a)葉綠素a含量多重比較；(b)葉綠素b含量多重比較；(c)葉綠素a、b含量比值多重比較。不同字母表示存在顯著差異，顯著水平(P<0.05)。

2.1.3 光質(zhì)和光周期對輪葉黑藻組培苗可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

方差分析結(jié)果顯示：光質(zhì)和光周期及其交互作用顯著影響輪葉黑藻組培苗可溶性糖和可溶性蛋白的含量。輪葉黑藻組培苗可溶性糖和可溶性蛋白含量在不同光照條件下的差異主要是由光周期引起的(表3)。

表3 不同光照條件下輪葉黑藻組培苗可溶性糖和蛋白含量的方差分析結(jié)果

紅光照射下可溶性糖的含量稍高于其他光照，其他光質(zhì)之間沒有差異，光周期在不同光質(zhì)下影響也不一致，白光照射下16 h/d光周期可溶性糖含量遠高于其他兩組，其他光照下光周期之間可溶性糖含量雖沒有太大差異，但8 h/d光周期均為最低；而紅光處理下可溶性蛋白含量最低，白光處理下最高，光質(zhì)的影響同樣不同，除白光下8 h/d光周期顯著低于其他兩組，剩余光照處理下不同光周期間沒有顯著差異(圖5)。

(a)可溶性糖含量多重比較；(b)可溶性蛋白含量多重比較。不同字母表示存在顯著差異，顯著水平(P<0.05)。

2.1.4 光質(zhì)和光周期對輪葉黑藻組培苗抗氧化酶體系的影響

方差分析結(jié)果顯示：輪葉黑藻組培苗的整個抗氧化酶體系均受光質(zhì)和光周期及其交互作用的顯著影響。輪葉黑藻組培苗抗氧化酶體系在不同光照條件下的差異主要是由光周期引起的(表4)。

表4 不同光照條件下輪葉黑藻組培苗抗氧化酶體系的方差分析結(jié)果

光周期對POD活性的影響在不同光質(zhì)下表現(xiàn)不同，8 h/d光周期下POD活性均最低，藍光中16 h/d高于12 h/d，而紅藍混合光中則是12 h/d高于16 h/d；對SOD活性來說，白光下不同光周期之間沒有顯著性差異，紅光和紅藍混合光下，16 h/d光周期下SOD活性最高，藍光下則是8 h/d最高；而對CAT活性來說，白光下不同光周期之間同樣沒有顯著性差異，其他3種光質(zhì)下8 h/d光周期下基本最低，12 h/d光周期下最高；而MDA含量除紅藍混合光外，其他3種光質(zhì)均為12 h/d>16 h/d>8 h/d，而光質(zhì)之間的比較則是白光>紅光>藍光>紅藍混合光(圖6)。

(a)POD活性多重比較；(b)SOD活性多重比較；(c)CAT活性多重比較；(d)MDA含量多重比較。不同字母表示存在顯著差異，顯著水平(P<0.05)。

2.2 底質(zhì)及遮光程度對輪葉黑藻組培苗生長的影響

2.2.1 底質(zhì)及遮光程度對輪葉黑藻形態(tài)指標和生物量的影響

方差分析結(jié)果顯示：株高受底質(zhì)類型和遮光程度及其交互作用的影響，而根數(shù)、芽數(shù)及各部分生物量則由底質(zhì)類型和遮光程度分別影響。輪葉黑藻形態(tài)指標和各部分生物量在不同底質(zhì)及遮光程度下的差異主要是由不同底質(zhì)類型引起的(表5)。

表5 不同底質(zhì)及遮光程度下輪葉黑藻形態(tài)指標和各部分生物量的方差分析結(jié)果

在種植前期，80%遮光下株高顯著增長，而中后期除沙子底質(zhì)外，不同遮光程度下株高無顯著差異，沙子底質(zhì)中不遮光處理株高最小；對不同底質(zhì)來說，泥土底質(zhì)和泥沙混合底質(zhì)下的株高無差異，沙子底質(zhì)株高最小。不遮光處理下輪葉黑藻生根最多，40%遮光和80%遮光下無顯著差異，而泥土底質(zhì)和泥沙混合底質(zhì)中的輪葉黑藻生根數(shù)遠多于沙子底質(zhì)。芽數(shù)基本呈現(xiàn)不遮光>40%遮光>80%遮光，但這種差異在種植早期和后期不明顯，對底質(zhì)來說，前中期泥土和泥沙混合底質(zhì)差異不明顯，均遠多于沙子底質(zhì)，種植后期，泥土底質(zhì)超過了泥沙混合底質(zhì)(圖7)。

(a)株高多重比較；(b)根數(shù)多重比較；(c)芽數(shù)多重比較。不同字母表示存在顯著差異，顯著水平(P<0.05)。

根部的干重基本呈現(xiàn)不遮光>40%遮光>80%遮光，但這種差異在種植前期和后期不明顯，泥土和泥沙混合底質(zhì)均遠多于沙子底質(zhì)。在種植的前期和后期，遮光程度對莖部干重的影響不顯著，在中期則基本呈現(xiàn)不遮光>40%遮光>80%遮光的趨勢；同時，在種植的中后期，泥土底質(zhì)下的輪葉黑藻莖部干重最大，沙子底質(zhì)下最小。除了泥沙混合底質(zhì)外，在種植的前期和后期，遮光程度對葉片部分的干重影響不顯著，而在中期，除了泥沙混合底質(zhì)外，基本呈現(xiàn)80%遮光>不遮光>40%遮光，而底質(zhì)的影響則為泥土>泥沙混合>沙子(圖8)。

(a)根部干重多重比較；(b)莖部干重多重比較；(c)葉片干重多重比較。不同字母表示存在顯著差異，顯著水平(P<0.05)。

2.2.2 底質(zhì)及遮光程度對輪葉黑藻生物量分配的影響

方差分析結(jié)果顯示：根部的生物量占比與個體生長差異無關(guān)，只受底質(zhì)類型和遮光程度影響，莖部的生物量占比只受遮光程度的影響，而個體間的生長差異影響了葉片生物量的占比，同時底質(zhì)類型和遮光程度也影響葉片生物量的占比(表6)。

表6 不同底質(zhì)及遮光程度對輪葉黑藻各部分生物量分配的影響

相同底質(zhì)下，不同遮光程度下輪葉黑藻根部生物量占比差異不大，尤其是種植后期基本持平；在種植前期，泥沙混合底質(zhì)下根部生物量占比略高于其他兩組，在種植后期，沙子底質(zhì)中的根生物量反超領(lǐng)先。種植前期和后期不同遮光處理下葉片生物量占比差異不顯著，中期時80%遮光下葉片生物量占比最大，而對底質(zhì)來說，不同底質(zhì)下葉片生物量占比差異也不顯著(圖9)。

(a)根部占比多重比較；(b)葉片占比多重比較。不同字母表示存在顯著差異，顯著水平(P<0.05)。

40%遮光處理下莖部生物量占比最高，前中期不同遮光間存在顯著差異，至種植后期差異縮小至不顯著，而底質(zhì)類型對根部生物量占比沒有影響(圖10)。

不同字母表示存在顯著差異；顯著水平(P<0.05)。

3 討論

3.1 光質(zhì)及光周期對輪葉黑藻組織培養(yǎng)的影響

光質(zhì)、光周期對植物的形態(tài)建成、生理生化特性、產(chǎn)量和品質(zhì)等眾多方面均有調(diào)控作用[9]。在本實驗中，紅光顯著提升組培苗干重，這與杜建芳等[10]對油菜的研究結(jié)果一致。研究表明藍光會抑制植物的生長，而本實驗中藍光下組培苗干重和莖長與其他光色不存在顯著差異，其原因可能為接種片段偏小，組培苗生長緩慢，初始片段造成的長度相對誤差較大，抵消了藍光的抑制作用。光周期對組培苗的干重和莖長有顯著影響，隨著光周期的延長，干重和莖長均先增大再減小，這與劉慶[11]對草莓的研究結(jié)果相同。

在一定范圍內(nèi)，光照可以促進原質(zhì)體或黃化體向葉綠體的轉(zhuǎn)化[12]。本實驗中，12 h/d光周期大幅促進組培苗葉綠素合成，張歡等[13]在對油葵芽苗菜的研究中也有類似的結(jié)論，在生長前期(第15天～第35天)藍光促進了葉綠素a的合成，抑制了葉綠素b的合成，故藍光下葉綠素a/b最大，紅藍混合光次之，陳祥偉等[14]對烏塌菜的研究也得到了相同的結(jié)論。

光質(zhì)對植物碳氮代謝有著重要作用，可溶性蛋白作為一種調(diào)控物質(zhì)，在植物生理代謝過程中發(fā)揮著重要作用，其含量是衡量植物生長水平的重要指標[15]；而可溶性糖則是一種營養(yǎng)物質(zhì)，為植物代謝提供碳和能力，并促進細胞壁的形成[16]，在一定程度上能反映植物的生長。本實驗中紅光顯著提升了組培苗可溶性糖的積累，同時降低了可溶性蛋白的含量，白光照射的可溶性蛋白含量最高；一般來說，光周期延長會增加植物的物質(zhì)積累[17]，雖然本實驗中8 h/d下物質(zhì)積累量最低，但不同光周期之間沒有顯著差異，原因可能是16 h/d下葉綠素含量太低，光合作用產(chǎn)物整體減少，而植物的氮代謝又和碳代謝相互依存，所以整體可溶性糖和可溶性蛋白在不同光周期間并沒有明顯差異和趨勢[18]。

光質(zhì)和光周期對抗氧化酶體系的影響，不同植物結(jié)果不同[19]。抗氧化酶主要參與活性氧的清除，對植物生長發(fā)育有重要的影響。SOD能催化植物體內(nèi)超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，隨后CAT和POD會立即將其分解為水，而MDA則是抗氧化酶體系代謝后的產(chǎn)物，抗氧化酶活性水平能反映植物抵抗環(huán)境脅迫的能力。本實驗中，光周期的影響因光質(zhì)的不同而改變，8 h/d下POD活性最低；而紅光和紅藍混合光下，16 h/d光周期提高了SOD的活性，藍光下8 h/d最高；而CAT活性是12 h/d>16 h/d>8 h/d，因此，光周期延長提高輪葉黑藻組培苗抗氧化酶活性。白光下MDA的含量最高，氧化程度較大，主要是因為組內(nèi)12 h/d的光周期帶來了巨大差異。除紅藍混合光外，剩余3種光質(zhì)下MDA含量呈現(xiàn)為12 h/d>16 h/d>8 h/d。

3.2 底質(zhì)及遮光程度對輪葉黑藻組培苗生長的影響

底質(zhì)對植物不僅有固定作用，還能提供營養(yǎng)物質(zhì)，不同的底質(zhì)類型對植物生長產(chǎn)生不同影響[20]。而遮光所帶來的光照差別也是重要影響因素。

本實驗中，沙子底質(zhì)中輪葉黑藻株高最低，芽數(shù)最少，生根數(shù)最多，這是由于沙子所含營養(yǎng)物質(zhì)少，且結(jié)構(gòu)松散，不易扎根，同時，沙子底質(zhì)中雖然根數(shù)最多，但各組織干重最小，說明沙子底質(zhì)無法為輪葉黑藻生長提供充足營養(yǎng)。同時沙子底質(zhì)中根部生物量占比最高，說明在沙子底質(zhì)中輪葉黑藻同比分配了更多的物質(zhì)和能量給根部。泥土底質(zhì)和泥沙混合底質(zhì)之間各項指標差異較小，泥土底質(zhì)中的株高、芽數(shù)、莖部干重和葉片干重稍高，而泥沙混合底質(zhì)則有更高的根部干重和根部生物量占比，說明泥土底質(zhì)更有助于輪葉黑藻的生長，泥沙底質(zhì)中同樣需要分配更多物質(zhì)能量用于扎根。

植物的趨光性使得在80%遮光下輪葉黑藻提升株高并增加葉片生物量占比以補償光照不足的影響來獲取光照，分配更多的物質(zhì)能量生長葉片進行光合作用。不遮光處理則提升了輪葉黑藻的根數(shù)、芽數(shù)、根部干重、莖部干重及根部生物量占比，說明輪葉黑藻在充足光照下優(yōu)先進行根莖的生長。40%的遮光下則莖部生物量占比提高。

總之，光質(zhì)和光周期對輪葉黑藻組培苗生長影響顯著，紅光顯著提高了組培苗的生長速度和品質(zhì)，而光周期的適當延長，也有利于輪葉黑藻組培苗生長，因此應(yīng)考慮選用紅色光照進行輪葉黑藻培養(yǎng)，光周期控制在12 h/d左右。同時，底質(zhì)類型和遮光程度對輪葉黑藻種植影響顯著，泥土底質(zhì)顯著提升了輪葉黑藻生長水平，而適度的遮光，也可以增加其生物量及各項形態(tài)指標，在實際應(yīng)用中，在沙子底質(zhì)種植輪葉黑藻則應(yīng)選擇較淺的水域種植，而在泥土或泥沙混合底質(zhì)中可以選擇較深的水域。