HA涂層對(duì)3D打印鈦合金材料安全性的影響

杜曉丹# 孫聰慧# 趙丹妹 姜愛莉 陳丹丹

鈦及鈦合金具有良好的生物相容性、抗腐蝕性及良好的力學(xué)性能，并且毒副作用相對(duì)較小，價(jià)格低廉[1-2]，因此在臨床上廣泛用于人體硬組織替代和修復(fù)[3]。

羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）和鈦合金都是目前醫(yī)療器械領(lǐng)域常用的骨修復(fù)、替代材料。鈦合金雖然能起到很好的支撐作用，但是不能誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)，植入體內(nèi)后還可能釋放金屬離子，對(duì)人體造成傷害。而HA是骨骼的組成成分之一，與其他磷酸鈣陶瓷（如磷酸三鈣）相比，在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，但是HA的機(jī)械強(qiáng)度很差[4]，抗拉能力低、韌性小，在體內(nèi)植入中容易斷裂[5]。因此，綜合兩者的優(yōu)點(diǎn)，將HA噴涂在鈦合金材料的表面，便形成了具有良好生物相容性的羥基磷灰石涂層[5-6]。近年來，隨著3D技術(shù)的迅速發(fā)展，多種3D技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用[7]，而3D打印鈦合金植入物更是廣泛用于各種類型的骨骼和關(guān)節(jié)損傷的修復(fù)和治療，與傳統(tǒng)的修復(fù)材料相比，3D打印鈦合金具有成型能力強(qiáng)、加工周期短的優(yōu)點(diǎn)，并且可以根據(jù)患者情況進(jìn)行個(gè)體化定制[8]，但目前較少對(duì)涂布羥基磷灰石涂層的3D打印植入物開展生物安全性研究，因此，本研究就對(duì)有涂層和無涂層的3D打印鈦合金材料進(jìn)行了全面的生物安全性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

3D打印鈦合金髖臼杯材料由納通生物科技（北京）有限公司提供，應(yīng)用的儀器是3D打印機(jī)（德國(guó)Eos金屬3D打印公司），樣品照片見圖1。

圖1 無HA涂層和有HA涂層材料實(shí)物圖片：A.無HA涂層材料，孔徑稀疏；B.有HA涂層材料表面發(fā)白，有些孔徑已覆蓋

研究所用細(xì)胞為L(zhǎng)929成纖維細(xì)胞和小鼠淋巴瘤細(xì)胞系（L5178Y TK+/-3.7.2C），TA97、TA98、TA100、TA102菌株，動(dòng)物為SPF級(jí)新西蘭大白兔6只（雄性，體重2.5～3 kg）和昆明小鼠30只（雄性，體重15～17 g），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK（京）2017-0013，全部由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。高密度聚乙烯是陰性對(duì)照材料（美國(guó)藥典委員會(huì)）。

研究所用試劑與儀器包括：MEM培養(yǎng)基和雙抗（北京索萊寶生物科技公司）；生理鹽水（河北國(guó)藥石家莊四藥有限公司）；玉米油（江西益普生物藥業(yè)有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma公司）；胎牛血清和1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）。倒置熒光顯微鏡1X71（日本奧林巴斯顯微鏡公司）；熒光酶標(biāo)儀SpectraMax M5（上海美谷分子儀器有限公司）；紫外分光光度計(jì)（日立科學(xué)儀器有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；電子天平（上海諾萱科學(xué)儀器有限公司）；搖床（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）；電熱水浴箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)分為空白對(duì)照組（MEM培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照組（高密度聚乙烯浸提液）、陽性對(duì)照組（10%DMSO）、有HA涂層樣品組和無HA涂層樣品組。所有組均用MEM培養(yǎng)基浸提后接種L929細(xì)胞1×104細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24 h，換液再孵育24 h，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征并拍照。然后加入MTT溶液繼續(xù)孵育2 h，棄去MTT，加入0.1 mL的異丙醇溶液，震蕩平板。用酶標(biāo)儀在570 nm、650 nm下測(cè)量吸光度值[9]。然后根據(jù)公式（1）來計(jì)算細(xì)胞存活率：

1.2.2 刺激試驗(yàn)

取6只新西蘭大白兔，分為4組：有HA涂層材料生理鹽水浸提組和無HA涂層材料生理鹽水浸提組，有HA涂層材料玉米油浸提組和無HA涂層材料玉米油浸提組。其中3只兔子左邊注射生理鹽水和玉米油對(duì)照，右邊注射有HA涂層材料生理鹽水浸提液和玉米油浸提液。另外3只兔子相同操作，右邊注射無HA涂層材料的浸提液。在注射的0、24、48、72 h觀察記錄各個(gè)注射部位的情況，對(duì)每個(gè)觀察期各注射部位的紅斑和水腫的組織反應(yīng)評(píng)分（見表1），并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 刺激反應(yīng)評(píng)分依據(jù)

三只兔子記分相加后除以3得出每一試驗(yàn)樣品和相應(yīng)空白對(duì)照的平均積分，試驗(yàn)樣品的平均積分減去空白對(duì)照的平均記分得到刺激指數(shù)。

1.2.3 急性毒性試驗(yàn)

取昆明小鼠30只，隨機(jī)分為6組，其中3組分別尾靜脈注射生理鹽水對(duì)照、有HA涂層和無HA涂層材料的浸提液，另外3組分別腹腔注射玉米油、有HA涂層和無HA涂層材料的玉米油浸提液。記錄注射后第1、2、3 d觀察到的動(dòng)物的毒性癥狀，并記錄體重變化，如發(fā)現(xiàn)死亡動(dòng)物則需要進(jìn)行尸檢并隔離瀕死動(dòng)物[10]。

1.2.4 溶血試驗(yàn)

試驗(yàn)分為陽性對(duì)照組（蒸餾水）、陰性對(duì)照組（生理鹽水）、有HA涂層材料浸提液組、無HA涂層材料浸提液組。將上述4組的離心管放入37℃恒溫水浴中孵育30 min。每管加入0.1 mL的稀釋血液，37℃孵育60 min，800g離心力下離心5 min，吸取上清液，用空白管溶液調(diào)零，紫外分光光度計(jì)在545 nm處測(cè)量各管的吸光度值。并按照公式（2）計(jì)算溶血率。根據(jù)ISO 10993-4:2017，溶血率小于5%為不具有溶血作用[11]。

式（2）中：HI為溶血率；A為試驗(yàn)組的吸光度值；B為陰性對(duì)照組的吸光度值；C為陽性對(duì)照組的吸光度值。

1.2.5 Ames試驗(yàn)

有HA涂層和無HA涂層材料分別用DMSO和生理鹽水浸提72 h。實(shí)驗(yàn)中分為6個(gè)組：生理鹽水陰性對(duì)照組，有HA涂層材料生理鹽水浸提液組，無HA涂層材料生理鹽水浸提液組，培養(yǎng)基陰性對(duì)照組，有HA涂層培養(yǎng)基浸提液組，無HA涂層培養(yǎng)基浸提液組。將上述6組同時(shí)設(shè)置活化組（添加S9混合液）和非活化組（不添加S9混合液）。冷凍保存的TA97、TA98、TA100、TA102菌株復(fù)蘇培養(yǎng)后，使用平板摻入法接種細(xì)菌，同時(shí)將材料浸提液及對(duì)照加入到平板中，活化組和非活化組進(jìn)行同樣的操作。等平板全部固化后，將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后進(jìn)行觀察。對(duì)比ISO 10993.3:2014規(guī)定判斷材料的毒性[12]。

1.2.6 小鼠淋巴瘤試驗(yàn)

使用小鼠淋巴瘤細(xì)胞系（L5178Y TK+/-3.7.2C）進(jìn)行TK基因突變?cè)囼?yàn)。有HA涂層和無HA涂層材料分別用生理鹽水和培養(yǎng)基浸提3 d作為浸提液組并將溶劑作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)中分為7個(gè)組：生理鹽水陰性對(duì)照組，有HA涂層材料生理鹽水浸提液組，無HA涂層材料生理鹽水浸提液組，培養(yǎng)基陰性對(duì)照組，有HA涂層培養(yǎng)基浸提液組，無HA涂層培養(yǎng)基提液組和陽性對(duì)照組。將上述7組同時(shí)設(shè)置活化組（添加S9混合液）和非活化組（不添加S9混合液），活化組樣品由細(xì)胞懸液、樣品浸提液或?qū)φ杖芤汉蚐9混合液、含血清的培養(yǎng)基混合。非活化組樣品由細(xì)胞懸液、樣品浸提液或?qū)φ杖芤汉蚉BS、含血清的培養(yǎng)基混合?；罨到y(tǒng)陽性劑采用的是甲磺酸甲酯（MMS），非活化系統(tǒng)采用的陽性劑為環(huán)磷酰胺（CTX）。將上述14組分別配制在離心管中，放入37℃、5%CO2的震蕩培養(yǎng)箱中接觸4 h。將上述混合液離心洗滌重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到75 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2 d，在培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞濃度重新調(diào)節(jié)為3×105個(gè)/mL繼續(xù)培養(yǎng)。

鋪板：將細(xì)胞懸液稀釋到8個(gè)細(xì)胞/mL。按每孔0.2 mL（即每孔接種1～2個(gè)細(xì)胞）進(jìn)行鋪板，每組接種兩塊平板。第0天的平板接種效率用PE0表示，第2天的平板接種效率用PE2表示。

TFT（三氟胸苷）拮抗平板：第二天表達(dá)結(jié)束后，取表達(dá)結(jié)束后的細(xì)胞離心，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為1×104個(gè)/mL，加入TFT（三氟胸苷）混勻，每孔0.2 mL（即每孔接種2 000個(gè)細(xì)胞）加入到96孔板中，培養(yǎng)12 d。分別計(jì)算相對(duì)存活率（RS）、每日細(xì)胞增長(zhǎng)率（DCG）、相對(duì)懸浮增長(zhǎng)率（RSG）、相對(duì)總存活率（RTG）和TFT抗性突變頻率（MF）。

平板接種率PE和突變率MF的計(jì)算：平板效率PE0、PE2及突變率MF均按泊松分布按公式（3）、公式（4）進(jìn)行計(jì)算。

W-不含集落的孔數(shù)；TW-總孔數(shù)；N-每孔的平均細(xì)胞數(shù)。

相對(duì)存活率（RS）、每日細(xì)胞增長(zhǎng)率（DCG）、相對(duì)懸浮增長(zhǎng)率（RSG）、相對(duì)總增長(zhǎng)率（RTG）按公式（8）進(jìn)行計(jì)算：

1.2.7 Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

復(fù)蘇后的Bhas 42細(xì)胞用DF5F傳代穩(wěn)定一代后，細(xì)胞融合率達(dá)到80%以上時(shí)收集細(xì)胞，啟動(dòng)試驗(yàn)組調(diào)細(xì)胞濃度4 000、8 000、12 000 cell/mL，配 制1、0.5、0.25、0.125μg/mL的3-MCA（3-甲基膽恩），每孔按0.05 mL鋪板；促癌試驗(yàn)組調(diào)細(xì)胞濃度4 000、6 000、8 000 cell/mL，配制1 000、500、250、125 ng/mL的TPA（佛波醇），每孔按0.1 mL鋪板。將以上條件分別進(jìn)行正交組合，按照每個(gè)組合8個(gè)復(fù)孔進(jìn)行鋪板，啟動(dòng)試驗(yàn)組在鋪板后第1 d加入0.05 mL的試驗(yàn)樣品；促癌試驗(yàn)在鋪板后的第4 d加入0.1 mL的實(shí)驗(yàn)樣品。培養(yǎng)7 d，用結(jié)晶紫染色觀察。使用上述得出的結(jié)論進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，除了每個(gè)樣品鋪整塊板子，其他操作同細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)，同時(shí)每組并行一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)，第7 d是用上述相同方法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，其他的繼續(xù)培養(yǎng)分別在第11、14 d時(shí)進(jìn)行換液，在第21 d時(shí)用吉姆薩對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布的兩組比較時(shí)使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率和頻數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和有HA涂層樣品組、無HA涂層樣品組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)如圖2所示。

圖2 各組別細(xì)胞生長(zhǎng)情況：A.陽性對(duì)照組細(xì)胞成圓形狀態(tài)，細(xì)胞死亡；B.空白對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)條形，且生長(zhǎng)密集，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；C.陰性對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)條狀，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)密集；D.有HA涂層樣品組細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)條狀，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)密集；E.無HA涂層樣品組細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)條狀，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)密集

根據(jù)公式（1）可以分別計(jì)算出有HA涂層樣品組的細(xì)胞存活率為（117±6）%，無HA涂層樣品組的細(xì)胞存活率為（106±14）%，存在一定的實(shí)驗(yàn)誤差，分別與陰性對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，細(xì)胞存活率在75%以上，無細(xì)胞毒性。說明有HA涂層的材料和無HA涂層的材料均對(duì)L929細(xì)胞無細(xì)胞毒性。

2.2 刺激試驗(yàn)

72 h后各組記分得到有HA涂層材料生理鹽水浸提液組和無HA涂層材料生理鹽水浸提液組刺激指數(shù)為0，不大于1，有HA涂層材料玉米油浸提液組和無HA涂層材料玉米油浸提液組刺激指數(shù)為0.06，不大于1。

2.3 急性毒性試驗(yàn)

在整個(gè)急性毒性試驗(yàn)過程中，各組均未出現(xiàn)毒性表現(xiàn)，也未出現(xiàn)死亡的實(shí)驗(yàn)個(gè)體，小鼠的體重在樣品浸提液注射后24、48、72 h后均呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)（見圖3）。因此，可以得出有HA涂層和無HA涂層的兩種材料均不具備急性毒性。樣品組和對(duì)照組的小鼠體重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 急性毒性試驗(yàn)中小鼠的體重變化

2.4 溶血試驗(yàn)結(jié)果分析

通過計(jì)算得到，有HA涂層材料浸提液組的溶血率為0.125%；無HA涂層材料浸提液組的溶血率為-0.257%；兩者的溶血率均不大于5%，因此可以判定兩種材料均不具有溶血作用。

2.5 回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

在實(shí)驗(yàn)的第三天通過計(jì)數(shù)各組的菌落數(shù)，如表2所示。

表2 回復(fù)突變?cè)囼?yàn)各組的菌落數(shù)

各組的回復(fù)突變的菌落數(shù)均在正常值范圍內(nèi)，因此兩種材料均不會(huì)導(dǎo)致組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株鼠傷寒沙門氏菌發(fā)生回復(fù)性突變。從側(cè)面印證了兩種材料均不具備遺傳毒性。

2.6 小鼠淋巴瘤試驗(yàn)

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)得出非活化鹽水對(duì)照組PE00.77，PE20.95，MF 67.0×10-6，活 化 鹽 水 對(duì) 照 組PE00.79，PE20.91，MF 80.2×10-6，非活化培養(yǎng)基對(duì)照組PE00.67，PE20.73，MF 136.2×10-6，活化組培養(yǎng)基對(duì)照組PE00.70，PE20.67，MF 138.9×10-6。加減S9的兩組的生理鹽水對(duì)照組和培養(yǎng)基對(duì)照組的PE0、PE2均在65%～120%，MF值在50×10-6～170×10-6之間，非活化陽性對(duì)照組小集落突變頻率S-MF 174.6×10-6比非活化生理鹽水對(duì)照和培養(yǎng)基對(duì)照高出150×10-6以上，活化陽性對(duì)照組小集落突變頻率S-MF 317.7×10-6比活化生理鹽水對(duì)照和培養(yǎng)基對(duì)照也高出150×10-6以上，證明該實(shí)驗(yàn)成立。其他各試驗(yàn)劑量組數(shù)據(jù)比較，各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.652），在此前提之下，各樣品組的突變頻率MF均大于或小于陰性對(duì)照組，且稍微高于陰性對(duì)照組的劑量組均不超過126×10-6。因此說明了有HA涂層和無HA涂層的兩種材料均不具有遺傳毒性。

2.7 Bhas42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

吉姆薩染液將細(xì)胞染色后在顯微鏡下進(jìn)行觀察，可以看出細(xì)胞多層重疊生長(zhǎng)而產(chǎn)生的細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶，在啟動(dòng)試驗(yàn)3-MCA組96孔板中細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶出現(xiàn)高于對(duì)照組和有HA涂層樣品組以及無HA涂層樣品組。在促癌試驗(yàn)中TPA陽性組96孔板中出現(xiàn)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶出現(xiàn)高于對(duì)照組、有HA涂層組和HA涂層樣品組。陽性誘導(dǎo)劑會(huì)使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化從而導(dǎo)致細(xì)胞不正常的增殖形成轉(zhuǎn)化灶，而正常的細(xì)胞經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，也會(huì)因?yàn)榧?xì)胞重疊生長(zhǎng)而產(chǎn)生細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶，但細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶出現(xiàn)的要少很多。因此說明了有HA涂層和無HA涂層的兩種材料均不具有細(xì)胞致癌性。

3 討論

目前，鈦合金的表面涂層呈現(xiàn)出多種技術(shù)復(fù)合的發(fā)展趨勢(shì)，并已成為近年來鈦合金加工制造領(lǐng)域的焦點(diǎn)，探索涂層表面改性新技術(shù)是未來鈦合金植入物材料的發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)其開展生物學(xué)評(píng)價(jià)也就成為材料能否最終走向臨床的研究重點(diǎn)。Guarise等[13]以透明質(zhì)酸鈉鹽、四丁基銨鹽、肝素等在Ti6Al4V合金表面制備sHA-DA涂層，用兔模型植入研究了Ti6Al4V合金表面HA-DA涂層的組織相容性。Zhu等[14]首次在Ti6Al4V合金表面制備了聚多巴胺-膠原涂層。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，Ti6Al4V合金表面膠原功能化后，人包皮成纖維細(xì)胞（HFF）與人永生角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaTs）有較好的黏附性。大鼠皮下植入實(shí)驗(yàn)表明，與Ti6Al4V或單純聚多巴胺涂層樣品相比，膠原修飾可減弱軟組織反應(yīng)，改善組織相容性。Song等[15]在Ti6Al4V基體上制備出5種不同的聚醚醚酮（PEEK）復(fù)合涂層。通過紅細(xì)胞觀察、溶血試驗(yàn)和血栓形成分析，評(píng)價(jià)了ZrO2顆粒增強(qiáng)聚醚醚酮涂層的血液相容性。Chen等[16]通過水熱處理結(jié)合疏水處理在Ti6Al4V合金表面制備超疏水層，研究了超疏水樣品的表面形態(tài)、表面粗糙度、相組成、元素組成、水接觸角和血液相容性。但在以往諸多文獻(xiàn)中對(duì)鈦合金及其涂層材料的研究中，對(duì)其生物學(xué)性能的研究較為有限，尤其是未見對(duì)其致癌性能評(píng)價(jià)方法的研究，較多關(guān)注的是涂層制備方法和涂層物理和化學(xué)性能的研究，同時(shí)也缺少對(duì)有涂層和無涂層多孔材料生物學(xué)性能的全面對(duì)比研究。本研究即是通過細(xì)胞毒性、刺激、急性毒性、溶血、遺傳毒性、致癌等試驗(yàn)對(duì)含有羥基磷灰石涂層和不含涂層的3D打印多孔鈦合金材料進(jìn)行了較為全面的毒性檢測(cè)對(duì)比研究。

在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，有HA涂層樣品組與無HA涂層樣品組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況與陰性對(duì)照組對(duì)比均呈現(xiàn)良好的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，且兩組的存活率均在100%以上，說明兩種材料均不具有細(xì)胞毒性，3D打印植入物涂布HA涂層后可以為細(xì)胞黏附和爬行提供安全的基質(zhì)結(jié)構(gòu)。

在刺激試驗(yàn)中，有HA涂層兩組和無HA涂層兩組與對(duì)照組相比沒有出現(xiàn)泛紅、水腫等皮膚刺激的癥狀，說明兩種材料均不具有刺激毒性，3D打印植入物涂布HA涂層后不會(huì)引發(fā)新的刺激毒性。

急性毒性試驗(yàn)中，有HA涂層的生理鹽水和玉米油組以及無HA涂層的生理鹽水和玉米油組均沒有出現(xiàn)嘔吐、眩暈、走路不穩(wěn)等臨床反應(yīng)，且每一組的體重均正常增長(zhǎng)，說明了兩種材料均不具有急性毒性，3D打印植入物涂布HA涂層后不會(huì)引發(fā)新的急性毒性。

在溶血試驗(yàn)中，有HA涂層組和無HA涂層組溶血率均不大于5%，可以判定兩種材料均不具有溶血作用，3D打印植入物涂布HA涂層后不會(huì)引發(fā)新的溶血作用。

在回復(fù)性突變?cè)囼?yàn)中，有HA涂層的生理鹽水和DMSO兩種浸提液組和無HA涂層兩種浸提液組的TA97、TA98、TA100、TA102的回復(fù)突變值均與陰性對(duì)照組相差不大。在小鼠淋巴瘤試驗(yàn)中，各樣品組在不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的情況下，樣品組與陰性對(duì)照組比較均表現(xiàn)正常，也證明了兩種材料都不具有遺傳毒性，3D打印植入物涂布HA涂層后不會(huì)引發(fā)新的遺傳毒性。

同時(shí)，現(xiàn)有的致癌性短期預(yù)測(cè)試驗(yàn)大多只限于檢測(cè)遺傳毒性致癌物，而不能檢測(cè)非遺傳毒性致癌物，因此建立快速、簡(jiǎn)便、可靠的體外方法檢測(cè)非遺傳毒性致癌物在植入物早期研發(fā)階段具有重要意義，是當(dāng)前安全性評(píng)價(jià)毒理學(xué)研究中亟需解決的問題。本研究建立了Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的方法應(yīng)用于植入物安全性評(píng)價(jià)中。Bhas 42細(xì)胞是將v-Ha-ras基因?qū)隑alb/c 3T3細(xì)胞中而建成的細(xì)胞系，可以判定植入物的非遺傳毒性。這對(duì)于長(zhǎng)期植入器械的安全性評(píng)價(jià)而言非常重要。本研究在致癌試驗(yàn)中，有HA涂層和無HA涂層材料在細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中均未出現(xiàn)惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶，證明了有HA涂層和無HA涂層的兩種材料都不具有遺傳致癌毒性，在細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)過程中有HA涂層和無HA涂層兩種材料有出現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶，但是與陽性組比較，細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶的數(shù)量遠(yuǎn)少于陽性組，因此可以證明兩種材料不具有非遺傳致癌毒性。

本研究結(jié)果表明，有HA涂層材料和無HA涂層材料均表現(xiàn)出良好的生物安全性，證明了這兩種材料均具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也一定程度證明了涂布HA涂層對(duì)鈦合金3D打印植入物的生物相容性具有積極意義，為鈦合金涂層材料和技術(shù)的發(fā)展提供了現(xiàn)實(shí)依據(jù)，也為未來評(píng)價(jià)更多種類的涂層化3D打印鈦合金植入醫(yī)療器械提供了試驗(yàn)方法的實(shí)踐依據(jù)。但本文也存在一定的局限性，開展的多數(shù)是體外研究，雖然也能夠反映部分長(zhǎng)期毒性的問題，但由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)壳皟H開展了短期毒性研究，因此對(duì)材料長(zhǎng)期毒性的探究還不充分。考慮到對(duì)一種植入的不可降解的醫(yī)療器械開展長(zhǎng)期毒性的必要性，將繼續(xù)開展材料的體內(nèi)及長(zhǎng)期毒性研究工作。

隨著對(duì)不同3D打印植入物涂層材料的探索和相關(guān)數(shù)據(jù)的逐步積累，我們一定能夠越來越好地利用3D打印技術(shù)和涂層技術(shù)，研發(fā)出更多具有優(yōu)良性能的相關(guān)產(chǎn)品，有效推動(dòng)金屬植入物克服目前存在的潛在毒性問題和生物相容性問題，造福越來越多的患者和家庭。