絕對穩(wěn)定固定對骨量減少長骨骨折愈合影響的實驗研究*

張俊 衛(wèi)琰 厲國定 尹偉忠 王健

股骨遠端骨折是老年人常見的骨折之一，主要由低能量損傷引起，多為簡單骨折[1-2]。對于老年股骨遠端骨折，采用鎖定鋼板聯合微創(chuàng)接骨術（minimally invasive plate osteosynthesis，MIPO）治療是目前的主流選擇[3]。MIPO的最佳適應證是干骺端粉碎性骨折及骨質疏松骨折[4]。一般認為，老年股骨遠端骨折多為骨質疏松骨折[5]，但隨著生活水平的提高，臨床發(fā)現多為骨量減少的簡單骨折[6]。有較多文獻報道，運用MIPO治療有時很難糾正簡單骨折[7-9]。由于鎖定鋼板強度較大，如果骨折端間隙過大，同時沒有合適的鋼板工作長度，很難有足夠的應變力誘導產生骨痂，易引起相關的并發(fā)癥[10-12]。近年來，通過拉力螺釘技術復位骨折端，結合鎖定鋼板固定老年股骨遠端骨折開展得越來越多，生物力學及臨床療效滿意[6,13-14]。為此，筆者以新西蘭大白兔為實驗對象，制備骨量減少模型，通過建立股骨骨折來模擬老年長骨骨折，探討骨折端加壓螺釘結合鎖定鋼板固定對骨折愈合的影響，以期為臨床治療的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選用5月齡發(fā)育成熟的雌性新西蘭大白兔36只，體重2.3～2.7 kg，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[倫理：prylz2020-078，動物使用許可證：SYXK（滬）2017-0002]。主要實驗藥物和試劑：甲潑尼龍琥珀酸鈉（methylprednisolone sodium succinate，MPS）（比利時輝瑞公司），Ⅰ型前膠原氨基端肽（procollagen type 1 N-terminal propeptide，P1NP）及Ⅰ型膠原羧基末端肽（cross-linked C-telopeptide of type 1 collagen，CTX）試劑盒（上海江萊生物科技有限公司），TRAP染色試劑盒（美國Sigma公司），BMP-2檢測試劑盒（英國Abcam公司）。主要實驗儀器和材料：雙能X線骨密度測定儀（美國GE公司），Micro-CT（比利時SkyScan 1172型），微型接骨板系統(tǒng)（山東威高骨科材料股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 骨量減少模型制備

用信封法隨機選取30只新西蘭兔構建骨量減少模型（包括模型組6只），另外6只為對照組。模型組肌注MPS，劑量1 mg/（kg·d），持續(xù)4周，對照組肌注等量生理鹽水。模型組和對照組進行骨密度（bone mineral density，BMD）、血清骨轉換指標（P1NP、CTX）及Micro-CT檢測。

1.2.2 骨折內固定模型制備

骨量減少模型制備成功后，余下24只大白兔用信封法隨機分為S1組（單純釘板系統(tǒng)，4周）、L1組（骨折端加壓螺釘結合鎖定鋼板，4周）、S2組（單純釘板系統(tǒng)，8周）和L2組（骨折端加壓螺釘結合鎖定鋼板，8周），每組6只。10%水合氯醛1 mL/kg開始從耳緣靜脈麻醉，沿右股骨外側做縱形切口，從肌間隙進入暴露股骨，用擺鋸由外上向內下斜形鋸斷股骨，建立45°左右股骨中段骨折模型。復位骨折端并用克氏針臨時固定，置入6孔微型加壓鎖定板（2.4系統(tǒng)），便于骨折端拉力螺釘的置入。S1、S2組：骨折近端及遠端分別植入2枚鎖定螺釘，在臀部肌注青霉素40萬U抗感染，每天1次，連續(xù)3 d。L1、L2組：先用拉力螺釘實現骨折端的堅強加壓，余處理同S1、S2組。術后即刻予以患肢管型石膏保護性固定4周。

1.3 觀察指標

1.3.1 BMD測定

MPS肌注前后均采用雙能X線吸收法（dual energy X-ray absorptiometry，DXA）檢測L3-L4椎體及左側股骨近端BMD。

1.3.2 血清骨轉換指標檢測

腹主動脈取血，離心并收集上層血清，用ELISA法檢測血清骨轉換指標（P1NP，CTX）的表達水平。

1.3.3 Micro-CT檢測

將大白兔處死，取出L5椎體，行Micro-CT掃描，檢測三維骨密度（BMD）、骨體積分數（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）與結構模型指數（SMI）等。

1.3.4 骨折術后影像學檢測

骨折術后4周S1、L1組兔X線攝片，隨后處死行Micro-CT掃描，觀察骨痂的生長情況。骨折術后8周，S2、L2組兔同樣處理。

1.3.5 三點彎曲力學測試

將股骨標本放置于生物力學機上，承載點的間距為20 mm，加載速度為2 mm/min直至發(fā)生骨折，記錄載荷位移曲線并計算生物力學指標。

1.3.6 組織病理學及免疫組織化學染色

骨折術后4、8周，骨痂標本脫鈣、脫水、石蠟包埋，切片行HE、Masson、番紅固綠及TRAP染色，行免疫組化觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）的表達變化。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體重變化

模型組與對照組體重在肌注前比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。肌注2周后，模型組體重出現較大幅度下降；肌注4周后，模型組體重回歸基線水平，對照組體重較基線上升明顯，各時間段兩組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組實驗兔體重變化（±s）

表1 兩組實驗兔體重變化（±s）

組別模型組對照組t值P值n 6 6 0周（kg）2.43±0.16 2.38±0.15 0.585 0.571 2周（kg）2.24±0.19 2.44±0.14-2.062 0.066 4周（kg）2.37±0.23 2.54±0.13-1.591 0.143

2.2 BMD檢測

模型組與對照組BMD在肌注前比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。肌注4周后，模型組腰椎及股骨近端BMD較基線出現明顯下降，對照組無顯著變化，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），模型組腰椎BMD是對照組均值減去1.7 SD，股骨近端BMD是對照組均值減去1.6 SD，見表2。

表2 兩組實驗兔肌注前后腰椎及股骨近端BMD的比較（±s）

表2 兩組實驗兔肌注前后腰椎及股骨近端BMD的比較（±s）

組別模型組對照組t值P值n 6 6腰椎（mg/cm2）0周 4周252±24 216±21 249±25 251±21 0.226 -2.844 0.826 0.017股骨近端（mg/cm2）0周 4周281±35 237±30 277±29 281±28 0.208 -2.622 0.840 0.026

2.3 血清骨轉換指標分析

與對照組比較，模型組血清學指標（P1NP、CTX）肌注4周后都有所升高，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組實驗兔肌注4周后P1NP及CTX水平變化的比較（±s）

表3 兩組實驗兔肌注4周后P1NP及CTX水平變化的比較（±s）

組別模型組對照組t值P值n 6 6 P1NP（ng/mL）6.83±0.65 5.79±0.46 3.215 0.009 CTX（ng/mL）7.19±0.34 6.55±0.44 2.862 0.017

2.4 Micro-CT檢測

肌注4周后，模型組與對照組腰椎三維BMD比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組腰椎三維BMD是對照組均值減去1.7 SD。模型組的骨微結構參數BV/TV、Tb.Th、Tb.N較對照組下降，Tb.Sp、SMI較對照組上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表4 兩組實驗兔肌注4周后L5椎體骨微結構參數的比較（±s）

表4 兩組實驗兔肌注4周后L5椎體骨微結構參數的比較（±s）

組別模型組對照組t值P值n66 BMD（mg/cm3）208.61±18.75 243.83±21.17-3.046 0.013 BV/TV（%）30.74±2.81 38.31±3.54-4.104 0.002 Tb.Th（mm）0.15±0.02 0.18±0.02-2.736 0.021 Tb.N（1/mm）2.23±0.24 2.61±0.27-2.568 0.028 Tb.Sp（mm）0.26±0.03 0.21±0.03 2.909 0.016 SMI 1.09±0.19 0.76±0.17 3.184 0.010

2.5 骨折術后X線片

S1組骨折線模糊，但尚未完全愈合；L1組骨折線基本消失。S2組骨折基本愈合，但有1例骨折端從模糊狀向清晰狀轉變，出現延遲愈合現象（見圖1C）；L2組已完全愈合。

圖1 骨折術后X線片：A.S1組；B.L1組；C.S2組；D.L2組

2.6 骨痂Micro-CT檢測

與S1組相比，L1組BV/TV更高，骨小梁厚度明顯、數量較多、分離度更低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表5；S2、L2組BV/TV、Tb.Th、Tb.N及Tb.Sp比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表6。

表5 兩組實驗兔骨折術后4周骨痂骨微結構參數的比較（±s）

表5 兩組實驗兔骨折術后4周骨痂骨微結構參數的比較（±s）

組別S1組L1組t值P值n 66 BV/TV（%）31.62±3.08 36.02±2.22-2.842 0.017 Tb.Th（mm）0.14±0.03 0.18±0.04-2.387 0.038 Tb.N（1/mm）4.24±1.35 6.14±0.94-2.828 0.018 Tb.Sp（mm）0.21±0.03 0.17±0.03 2.314 0.043

表6 兩組實驗兔骨折術后8周骨痂骨微結構參數的比較（±s）

表6 兩組實驗兔骨折術后8周骨痂骨微結構參數的比較（±s）

組別S2組L2組t值P值n 66 BV/TV（%）43.40±3.16 45.09±3.93-0.817 0.433 Tb.Th（mm）0.19±0.04 0.20±0.03-0.771 0.459 Tb.N（1/mm）6.54±1.46 6.99±1.72-0.487 0.636 Tb.Sp（mm）0.17±0.04 0.16±0.03 0.799 0.443

2.7 生物力學研究分析

術后4周，兩組最大載荷及彈性模量比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表7。術后8周，兩組最大載荷及彈性模量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表8。

表7 兩組實驗兔骨折術后4周生物力學結果（±s）

表7 兩組實驗兔骨折術后4周生物力學結果（±s）

組別S1組L1組t值P值n66最大載荷（N）248.33±10.15 269.83±14.03-3.040 0.012彈性模量（GPa）0.28±0.03 0.35±0.05-3.028 0.013

表8 兩組實驗兔骨折術后8周生物力學結果（±s）

表8 兩組實驗兔骨折術后8周生物力學結果（±s）

組別S2組L2組t值P值n66最大載荷（N）323.67±50.21 370.33±23.92-2.055 0.067彈性模量（GPa）0.34±0.04 0.38±0.03-2.098 0.062

2.8 組織學觀察

HE染色：S1組為典型的纖維骨痂及軟骨骨痂，纖維骨痂較明顯；L1組以明顯的軟骨骨痂為主。S2組有大量硬骨痂出現，骨小梁粗細不均；L2組的硬骨痂體積大，骨小梁粗細均勻（見圖2）。

圖2 骨折術后HE染色（×100）：A.S1組；B.L1組；C.S2組；D.L2組

Masson染色：S1組大部分由淡紅色的組織構成，藍染的纖維軟骨相對明顯；L1組主要由淡紅色的組織構成，藍染的纖維軟骨較少。S2組紅染的組織逐漸增多；L2組骨組織成熟度較高（見圖3）。

圖3 骨折術后Masson染色（×100）：A.S1組；B.L1組；C.S2組；D.L2組

番紅固綠染色：S1組有部分纖維軟骨（淡紅色），周圍有較多骨性組織（藍色）；L1組主要由大量骨性組織為主（藍色）。S2組出現大量的綠色骨性組織；L2組由大量綠色骨性組織構成，排列整齊（見圖4）。

圖4 骨折術后番紅固綠染色（×100）：A.S1組；B.L1組；C.S2組；D.L2組

TRAP染色：S1組破骨細胞數量為（9.7±2.7），L1組為（6.3±1.9），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=2.469，P=0.033）。S2組（5.5±2.4），L2組（3.3±1.6），兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.813，P=0.100）（見圖5）。

圖5 骨折術后TRAP染色（×100）：A.S1組；B.L1組；C.S2組；D.L2組

2.9 免疫組化分析

BMP-2表達：S1組（10.3±2.2），L1組（12.5±2.7），兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.522，P=0.159）。S2組（5.8±1.5），L2組（4.8±1.8），兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.041，P=0.322）（見圖6）。

圖6 骨折術后骨痂BMP-2表達（×100）：A.S1組；B.L1組；C.S2組；D.L2組

3 討論

隨著人口老齡化趨勢的加劇，低能量損傷引起的老年股骨遠端骨折逐年增加，其中有一大部分為骨量減少性骨折，骨折類型主要為A1、A2、C1型簡單骨折[2]。閉合復位、運用MIPO微創(chuàng)插板治療具有創(chuàng)傷小、可避免對軟組織廣泛剝離的優(yōu)點，因此是治療該類骨折的首選方法[3]。然而，許多學者通過研究發(fā)現，股骨遠端骨折中A1、A2、C1型簡單骨折采用MIPO治療有時很難獲得滿意復位，尤其是螺旋形骨折，容易導致骨折延遲愈合等一系列并發(fā)癥的發(fā)生[10-12]。M?rdian等[14]通過生物力學研究發(fā)現，在A1型老年股骨遠端骨折中運用骨折端加壓螺釘結合鎖定鋼板固定后，骨折端剪切微動出現明顯降低，有利于骨折愈合[15]。Chung等[6]對A1、A2、C1型老年股骨遠端骨折進行臨床分析，發(fā)現骨折端使用螺釘固定后骨折愈合時間提早，術后1年愈合率更高，同時并發(fā)癥更少，效果優(yōu)于傳統(tǒng)MIPO治療方式。

在上述研究背景下，本研究首先對雌兔采用肌注MPS的方法誘導骨量減少模型來模擬骨量減少的老年患者。兔與人類有相似的哈佛氏系統(tǒng)，骨骼轉化快，適合作為激素性骨量減少模型的研究[16]；兔的骨骼較大、價格低廉、便于長期動態(tài)觀察，因此在開放性骨折模型中有著廣泛的應用。本實驗筆者選擇新西蘭大白兔作為實驗動物，以1mg/（kg·d）的劑量MPS肌注4周，肌注2周后模型組體重出現較大幅度下降，肌注4周后模型組體重回歸基線水平，對照組體重較基線平穩(wěn)升高，與既往文獻報道一致[17]。與對照組相比，模型組腰椎、股骨近端BMD及腰椎三維BMD降低幅度達到均值減去1.0 SD以上到2.5 SD之間，參考WHO的判定標準[18]，可以判定為骨量減少。與對照組相比，模型組P1NP和CTX在MPS肌注4周后都有所升高（P＜0.05），P1NP和CTX明顯提高可以在一定程度上反映患者存在骨質疏松[19]，本研究結果提示骨組織的高轉化狀態(tài)，預示模型組向骨量減少方向進展。

Micro-CT能對骨的形態(tài)結構行三維角度評估，有助于了解骨質疏松的病理結構改變[20]。本研究Micro-CT掃描結果發(fā)現，模型組實驗兔MPS肌注4周后L5椎體骨微結構參數BV/TV、Tb.Th、Tb.N較對照組下降，同時Tb.Sp、SMI較對照組上升。BV/TV代表骨小梁組織骨量含量的多寡，Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp是評價骨小梁形態(tài)結構的指標，SMI代表組織骨小梁板狀結構與桿狀結構一定比例的參數，數值增大代表骨小梁結構從板狀結構向桿狀結構轉變[21]，松質骨結構出現退變。本實驗模型組BV/TV、Tb.Th、Tb.N降低，Tb.Sp、SMI增加，代表分解代謝占優(yōu)勢，與其他文獻[22]報道一致，結合BMD及血清骨轉化指標，可以認為MPS肌注4周后成功建立兔骨量減少模型。

Baofeng等[23]通過甲基潑尼松龍誘導法，以1 mg/（kg·d）的劑量對雌兔肌注8周，發(fā)現腰椎BMD和骨量均出現下降。龔健等[17]通過肌注甲強龍1.5 mg/（kg·d），持續(xù)28 d，之后將劑量改為0.35 mg/kg以維持骨量持續(xù)丟失，每周3次，持續(xù)8周，成功構建骨質疏松兔模型。上述研究構建的是骨質疏松模型，本實驗以1 mg/（kg·d）的劑量MPS肌注4周構建骨量減少模型，激素劑量或持續(xù)時間較上述研究短，但研究方法相似，并成功建立了模型。

X線片是最常用的觀察骨折生長情況的方式，通過X線片可以直觀反映骨折端骨痂生長愈合的程度。本研究X線片發(fā)現，S1組骨折線模糊，L1組骨折線基本消失，S2組骨折基本愈合，L2組已完全愈合，研究說明骨折端使用加壓螺釘有利于骨折的早期愈合，同時發(fā)現S2組有1例出現骨折延遲愈合現象，與臨床工作中發(fā)現的問題類似[6]，簡單骨折采用橋接鋼板固定的方式達到相對穩(wěn)定可能會延長骨折愈合時間，甚至出現骨不連。骨折端Micro-CT掃描及三維重建可以清晰地顯示骨痂內部的細節(jié)情況。本研究Micro-CT掃描發(fā)現，L1組BV/TV、Tb.Th、Tb.N較S1組上升，同時Tb.Sp較S1組下降（P＜0.05）。Plecko等[24]動物實驗研究與本研究結果類似，發(fā)現使用骨折端加壓螺釘結合鎖定鋼板后，術后6周骨內膜骨痂形成量最多，骨折端加壓螺釘固定有利于早期形成骨痂。本實驗S1組最大載荷為（248.33±10.15）N，L1組為（269.83±14.03）N（P＜0.05），生物力學結果證實骨折端加壓螺釘固定后在骨折愈合早期有更佳的力學穩(wěn)定性；S2與L2組骨痂骨微結構參數及生物力學均無明顯差異，表明骨折愈合后期兩種固定方式效果相當，與Plecko等[24]報道一致。

本研究通過HE、Masson及番紅固綠染色形象地展示了不同成熟度的骨痂及骨小梁結構，發(fā)現L1、L2組骨痂相對更為成熟；TRAP染色及免疫組化揭示破骨細胞及成骨細胞在愈合中的分布，發(fā)現S1組破骨細胞數量明顯多于L1組（P＜0.05），雖然L1組BMP-2含量稍高，但差異無統(tǒng)計學意義。研究表明骨折端加壓螺釘固定能夠有利于骨痂組織的早期形成，有利于骨小梁的早期改造與重塑，能夠在骨組織愈合時抑制破骨細胞的活動，與既往文獻報道一致[24]。

綜上所述，在治療骨量減少性長骨骨折時，骨折端加壓螺釘結合鎖定鋼板固定有助于早期形成骨痂以及骨折的快速愈合。骨折端無拉力螺釘固定時，有發(fā)生骨折延遲愈合或骨折不愈合的風險。