《中華人民共和國藥典》2020年版中防己薄層色譜鑒別研究

曹樸瓊，陶明寶，楊深應，趙 霞，陳 琪，顧小迪

(1.保山市食品藥品檢驗檢測中心，云南 保山 678000；2.保山中醫(yī)藥高等?？茖W校，云南 保山 678000)

防己為防己科粉防己(StephaniatetrandraS.Moore)的干燥根，具有祛風止痛、利水消腫的功效，用于風濕痹痛、水腫腳氣、小便不利、濕疹瘡毒[1]。其主要化學成分為生物堿類，包括粉防己堿、防己諾林堿、輪環(huán)藤酸堿等[2-3]?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版防己標準中鑒別(2)項下的薄層色譜鑒別以防己諾林堿、粉防己堿為對照，缺乏對照藥材對照，同時使用的展開劑中含有易制毒化學物三氯甲烷。三氯甲烷對檢測人員具有較大的危害，且受公安部管制，試劑獲得比較困難，宜進行優(yōu)化。本次實驗研究是在藥典標準上，查閱相關文獻[4-8]，對防己薄層色譜方法進行優(yōu)化，增加防己對照藥材對照，去除三氯甲烷有毒物質，采用硅膠GF254薄層板直接在紫外光燈(254 nm)下檢視，不噴顯色劑，簡化顯色程序，凸顯了薄層色譜法準確、快速、廉價、專屬性強的特點，為防己薄層色譜鑒別的進一步完善提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

賽多利斯CP225D電子天平(德國賽多利斯公司)，硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板(青島海洋化工、煙臺市化學工業(yè)研究所)。

1.2 試藥

防己對照藥材(批號：121279-201502 )、防己諾林堿對照品(批號：110793-201807)、粉防己堿對照品(批號：110711-201609)，均購自中國食品藥品檢定研究院；防己樣品,均來自云南省藥品評價抽檢專項(樣品A，產(chǎn)地江西，批號：190901；樣品B，產(chǎn)地江西，批號：190901；樣品C，產(chǎn)地江西，批號：20120703；樣品D，產(chǎn)地浙江，批號：180303；樣品E，產(chǎn)地江西吉安，批號：190701；樣品F，產(chǎn)地河南，批號：2103002；樣品G，產(chǎn)地江西，批號：20190601；樣品H，產(chǎn)地安徽，批號：190401)；甲醇、乙醇、乙酸乙酯等試劑，均為分析純(天津市風船化學試劑科技有限公司)，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 《中華人民共和國藥典》2020年版一部方法

《中華人民共和國藥典》2020年版一部[1]防己【鑒別】(2)：取本品粉末 1 g，加乙醇 15 mL,加熱回流 1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇 5 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取粉防己堿對照品、防已諾林堿對照品，加三氯甲烷分別制成 1 mg/mL 的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各 5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇-5%濃氨試液(體積比6∶1∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液,置日光下檢視。薄層色譜圖見圖1。

1.粉防己堿、防己諾林堿混合對照；3～6.供試品：A、B、C、D

2.2 改進方法

取本品粉末 1 g，加2%鹽酸甲醇溶液 15 mL，加熱回流 1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇 5 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取防己對照藥材 1 g，同法制成對照藥材溶液。再取粉防己堿對照品、防已諾林堿對照品，加乙醇分別制成 1 mg/mL的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各 5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%濃氨試液(體積比7∶1∶0.7∶0.3)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視。薄層色譜圖見圖2。

1. 粉防己堿、防己諾林堿混合對照； 2. 防己對照藥材； 3～10. 供試品：A、B、C、D、E、F、G、H。

2.3 方法學考察

對薄層色譜鑒別方法進行耐用性考察。考察不同溫度、濕度和不同薄層板等影響因素，確保方法的可靠性。

2.3.1 不同溫度的考察

取薄層板點樣，分別在 4 ℃(a)和室溫 26 ℃(b)下展開顯色檢視，結果見圖3。結果表明，在室溫 26 ℃ 條件下展開較好。

2.3.2 不同濕度的考察

取供試品與對照藥材、混合對照品溶液，按“2.2”項下方法，在室溫條件下，分別在環(huán)境濕度相對濕度為43%(c)、75%(d)的條件下分別展開，結果如圖3。結果表明，不同濕度條件下，各斑點分離度均滿足要求。

2.3.3 不同品牌的薄層板考察

取本品，分別在硅膠GF254薄層板(青島海洋化工)(e)與硅膠GF254薄層板(煙臺市化學工業(yè)研究所)(f)的薄層板點樣，展開，結果見圖3。結果表明，不同薄層板上主斑點均能較好分離，但青島海洋化工薄層板上各主斑點更清晰，優(yōu)選青島海洋化工硅膠GF254薄層板。

a.4 ℃；b.26 ℃；c.相對濕度為43%；d.相對濕度為75%；e.硅膠GF254薄板層(青島海洋化工);f.硅膠GF254薄板層(煙臺市化學工業(yè)研究所)。

2.4 供試品色譜圖

吸取供試品溶液和對照藥材溶液、混合對照品溶液各 5 μL，按“2.2”項下方法點于同一青島硅膠GF254薄層板上，結果見圖2。結果表明，此方法分離度好，較原標準中顯色斑點多，可用于防己鑒別。

3 討論

3.1 提取溶劑考察

考察了甲醇、乙醇、2%鹽酸甲醇[1]，發(fā)現(xiàn)防己對照藥材用甲醇、乙醇提取液，斑點顏色較淺；用2%鹽酸甲醇提取液，斑點顏色較深。故選擇2%鹽酸甲醇作為提取溶劑。

3.2 提取方法考察

以2%鹽酸甲醇為提取溶劑，考察回流 1 h、回流 30 min、超聲 1 h、超聲 30 min，發(fā)現(xiàn)4種提取方法對防己諾林堿和粉防己堿沒有顯著差異，但其余2個斑點在回流 1 h 條件下斑點更清晰，故選擇加熱回流 1 h 作為提取方法。

3.3 點樣量考察

分別對 3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL 點樣量進行了考察，結果表明，4 μL 和 5 μL 點樣量斑點較清晰，6 μL、7 μL 存在不同程度的拖尾， 故采用 5 μL 為點樣量。

3.4 展開劑及薄層板的考察

結合參考文獻[4-8]，考察了展開劑——三氯甲烷-丙酮-甲醇-5%氨水(體積比6∶1∶1∶0.1)系統(tǒng)、正丁醇-丙酮-甲醇-5%氨水(體積比6∶1∶1∶0.1)系統(tǒng)、乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%氨水(體積比7∶1∶0.7∶0.3)系統(tǒng)，薄層板——硅膠G和硅膠GF254。結果表明，三氯甲烷系統(tǒng)檢視斑點較少，正丁醇系統(tǒng)拖尾，乙酸乙酯系統(tǒng)斑點數(shù)最多，也最明顯，且分離度好 。試驗中發(fā)現(xiàn)，5%氨水對斑點的Rf值影響較大，故考察了氨水的不同濃度及用量，結果發(fā)現(xiàn)：用乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%氨水(體積比7∶1∶0.7∶0.3)時，分離效果最好。考察了硅膠G板展開后噴顯色劑和硅膠GF254板直接看熒光，發(fā)現(xiàn)：硅膠G板除粉防己堿和防己諾林堿斑點比較明顯外，其余斑點顯色不清楚，而GF254板能呈現(xiàn)較好的4個斑點，故選擇硅膠GF254板，置紫外光燈(254 nm)下檢視。

3.5 藥典方法和改進后方法的對比

藥典方法只用粉防己堿和防己諾林堿作為對照，無對照藥材對照，不能全面反映藥材質量。改進后方法增加了對照藥材對照，供試品在與對照藥材色譜相應位置上，能展現(xiàn)較明顯的4個斑點，顯示出更多鑒別信息；在展開劑組分方面，藥典法展開劑中含有毒性較大的易制毒化學品三氯甲烷，本試驗把三氯甲烷換為乙酸乙酯，毒性較低且還能展現(xiàn)更多的化學成分，混合對照品的溶劑三氯甲烷也換成毒性較小的乙醇，在日常檢驗過程中降低對實驗人員的危害。

4 結論

該方法專屬性強，分離度好，檢視簡便，可為防己質量標準提高完善提供參考。