響應(yīng)面法優(yōu)化液體發(fā)酵樺褐孔菌多糖的制取

董婷婷，馬晨曦，郭 娜，劉 超，李鳳林

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是一種具有多種藥理功能的大型真菌，其中含有的多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎等多重藥理作用[1-5]。樺褐孔菌野生型子實體主要生長于高寒地區(qū)樺樹的樹皮上，生長周期緩慢，導(dǎo)致子實體產(chǎn)量受限。但通過深層液體發(fā)酵技術(shù)獲得的樺褐孔菌菌絲體與子實體相比，在生產(chǎn)周期、產(chǎn)量及成本方面具有顯著優(yōu)勢[6]。利用液體發(fā)酵法制備樺褐孔菌菌絲體，提取活性多糖，為樺褐孔菌后續(xù)的研究提供參考。

活性多糖的提取需破壞植物細(xì)胞壁并且利用極性溶劑液進(jìn)行浸提，故細(xì)胞壁的破壞程度和浸提方法對植物多糖的提取量和提取速度具有直接影響。徐曇燁等人[7]利用超聲波的空化作用使細(xì)胞壁破裂輔助提取樺褐孔菌多糖。王艷波[8]利用酶破壞細(xì)胞壁的方法輔助提取多糖。使用酶-超聲波協(xié)同提取法，該方法不僅能特異性水解細(xì)胞壁中的纖維素，而且能夠利用超聲波作用加大細(xì)胞壁破裂程度，對比其他提取方法，兩者結(jié)合可以顯著增加多糖的溶出率和溶出速度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

樺褐孔菌菌種（BNCC 117822）。

1.1.2 纖維素酶

纖維素酶，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，酶活力10 萬U/g。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體發(fā)酵培養(yǎng)樺褐孔菌菌絲體

（1）液體發(fā)酵培養(yǎng)基。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯煮出液1.0 L，葡萄糖40.0 g，KH2PO43.0 g，Mg-SO4·7HO21.5 g，維B110 mg。馬鈴薯煮出液1 L。

（2）液體發(fā)酵條件。在無菌環(huán)境中，用接種鏟將斜面固體培養(yǎng)基中的菌種切塊（0.5 cm×0.5 cm），接種于裝有150 mL 液體發(fā)酵液的錐形瓶中，將錐形瓶置于25 ℃下（恒溫振蕩培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)13 d，即可得到樺褐孔菌菌絲體。

（3）菌絲體預(yù)處理。用純水將液體發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體清洗后，篩網(wǎng)過濾，經(jīng)真空冷凍干燥后粉碎，過60 目篩后備用。

1.2.2 樺褐孔菌多糖的制備

菌絲體干粉→溶解→纖維素酶與超聲波協(xié)同提取→滅酶→離心→蒸發(fā)濃縮→醇沉→離心→乙醇洗滌→真空冷凍干燥→樺褐孔菌粗多糖。

精密稱取樺褐孔菌菌絲體干燥樣品，加入定量的纖維素酶，并加入定量純水進(jìn)行溶解，設(shè)定好超聲功率、溫度和時間后，進(jìn)行酶-超聲波協(xié)同提取。提取結(jié)束后，迅速升溫至100 ℃進(jìn)行滅酶處理10 min，將提取液冷卻至室溫后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心15 min，取上清液，將上清液蒸發(fā)濃縮至10 mL，加入95%乙醇溶液30 mL，于4 ℃下靜置過夜后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心15 min，收集沉淀，用乙醇洗滌3 次，將沉淀全部溶解，冷凍干燥至恒質(zhì)量，即得樺褐孔菌粗多糖[8-10]。

1.2.3 多糖測定

（1）苯酚硫酸法原理。樣品中水溶性糖和水不溶性多糖經(jīng)鹽酸溶液水解或水解醇沉后轉(zhuǎn)化成還原糖，水解物在硫酸的作用下，迅速脫水生成糖衍生物，并與苯酚反應(yīng)生成橙黃色溶液，其顏色深淺與糖含量成正比，可在波長486 nm 處采用分光光度儀測得溶液吸光度，計算出多糖的質(zhì)量濃度。該方法試驗時受蛋白質(zhì)影響非常小，基本可以忽略，成本低、靈敏度高，是檢測多糖的一種常見方法。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。準(zhǔn)確稱取干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，用蒸餾水溶解，定容至1 000 mL 容量瓶中，配成0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精密移取0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20，1.40，1.60 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL具塞比色管中，加蒸餾水至2.0 mL，再各加5%苯酚溶液1.0 mL，充分振搖均勻，迅速加入濃硫酸10 mL，振搖5 min，反應(yīng)液靜止放置10 min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，以試劑空白作為參比液，用紫外可見分光光度計于波長486 nm 處測定系列不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液吸光度，以多糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）樣品多糖含量的測定[11-12]。將提取后的多糖溶于一定量蒸餾水中進(jìn)行復(fù)溶，充分溶解并冷卻至室溫，過濾，精確量取0.5 mL 上清液，加入25 mL具塞比色管中，加蒸餾水至2.0 mL，之后按1.2.3（2）中操作進(jìn)行，則得到樣品中多糖質(zhì)量濃度，同時做空白試驗。

按照以下公式計算提取的活性多糖的得率：

式中：Y——多糖得率，%；

C——樣品溶液的多糖質(zhì)量濃度，g/mL；

V——供試液的體積，mL；

m——樺褐孔菌菌絲體質(zhì)量，g。

1.2.4 酶-超聲波輔助提取單因素試驗設(shè)計

（1）超聲功率對樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響。準(zhǔn)確稱取5 份樺褐孔菌子實體粉末，分別放入燒杯中并編號，在超聲時間為15 min，酶添加量為3%，料液比為1∶30（g∶mL），浸提溫度為55 ℃條件下，考查不同超聲功率200，250，300，350，400 W 對樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響。

（2）超聲時間對樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響。準(zhǔn)確稱取5 份樺褐孔菌子實體粉末，分別放入燒杯中并編號，在超聲功率為300 W，酶添加量為3%，料液比為1∶30（g∶mL），浸提溫度為55 ℃條件下，考查不同超聲時間5，10，15，20，25 min對樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響。

（3）酶添加量對樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響。準(zhǔn)確稱取5 份樺褐孔菌子實體粉末，分別放入燒杯中并編號，在超聲功率為300 W，超聲時間為15 min，料液比為1∶30（g∶mL），浸提溫度為55 ℃條件下，考查不同酶添加量（占樺褐孔菌添加量）1%，2%，3%，4%，5%對樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響。

（4）料液比對樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響。準(zhǔn)確稱取5 份樺褐孔菌子實體粉末，分別放入燒杯中并編號，在超聲功率為300 W，超聲時間為15 min，酶添加量為3%，浸提溫度為55 ℃條件下，考查不同 料 液 比1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40，1 ∶50（g∶mL）對樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響。

（5）浸提溫度對樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響。準(zhǔn)確稱取5 份樺褐孔菌子實體粉末，分別放入燒杯中并編號，在超聲功率300 W，超聲時間15 min，酶添加量3%，料液比1∶30（g∶mL）條件下，考查不同浸提溫度35，45，55，65，75 ℃對樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以樺褐孔菌菌絲體多糖的得率為響應(yīng)值（Y），以對響應(yīng)值影響最大的3 個因素（超聲功率、酶添加量、浸提溫度）為自變量，采用Box-behnken 設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗以達(dá)到優(yōu)化樺褐孔菌菌絲體提取工藝的目的。

響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

采用Excel 2010 對單因素試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖，進(jìn)行顯著性分析。運用Design Expert 8.061 中的Box-behnken 中心試驗設(shè)計對試驗結(jié)果進(jìn)行分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

按照“1.2.3 多糖測定”繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸曲線方程為Y=14.23 4X-0.013，R2=0.997 8，呈良好的線性關(guān)系，線性范圍為0.01～0.10 mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗分析

超聲功率對樺褐孔菌多糖得率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對樺褐孔菌多糖得率的影響

由圖2 可知，超聲功率對樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響較大，隨著超聲功率的增加，多糖得率逐漸上升，超聲功率為200～300 W 時，多糖得率增加顯著，在300 W 時達(dá)到最大值，300～400 W 時可能由于功率過高，多糖鏈斷裂，使多糖得率下降[13]。因此，超聲功率300 W 為最佳的工藝參數(shù)。

超聲時間對樺褐孔菌多糖得率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對樺褐孔菌多糖得率的影響

由圖3 可知，隨超聲時間的增加，多糖得率緩慢上升，在超聲時間為15 min 時達(dá)到最大，之后緩慢下降，可能由于時間延長，超聲波對糖有降解作用。因此，超聲時間15 min 為最佳工工藝。

酶添加量對樺褐孔菌多糖得率的影響見圖4。

圖4 酶添加量對樺褐孔菌多糖得率的影響

由圖4 可知，酶添加量對多糖得率有顯著影響。在酶添加量為1%～3%時，隨著酶添加量的增加，多糖得率逐漸上升，當(dāng)酶添加量為3%時得率為最大，超過3%后得率開始下降，原因在于底物量一定，而酶已飽和。因此，酶添加量3%為最佳工藝參數(shù)。

料液比對樺褐孔菌多糖得率的影響見圖5。

圖5 料液比對樺褐孔菌多糖得率的影響

由圖5 可知，料液比為1∶10～1∶30 時多糖得率逐漸增加，在1∶30 時達(dá)到最大，之后多糖得率逐漸下降，這可能是因為增加溶劑使酶濃度降低，導(dǎo)致多糖得率下降。因此，料液比1∶30 為最佳工藝參數(shù)。

浸提溫度對樺褐孔菌多糖得率的影響見圖6。

圖6 浸提溫度對樺褐孔菌多糖得率的影響

由圖6 可知，不同浸提溫度對多糖得率有極顯著影響。隨著溫度的升高，多糖得率逐漸變大，在55 ℃時達(dá)到最大值，之后增加溫度，多糖得率反而逐漸下降，原因可能是溫度升高，酶蛋白變性，酶活力減弱，使多糖得率下降。因此，浸提溫度55 ℃為最佳工藝參數(shù)。

2.3 響應(yīng)面法試驗結(jié)果及分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

以多糖得率為響應(yīng)值，固定料液比為1∶30（g∶mL），超聲時間為15 min 的條件下，以超聲功率（A）、酶添加量（B）、浸提溫度（C）為自變量，采用Box-behnken 進(jìn)行試驗。

酶-超聲波提取的Box-behnken 試驗見表2。

表2 酶-超聲波提取的Box-behnken 試驗

使用Design Expert 對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多元回歸擬合，得出響應(yīng)值（Y）對A、B、C 的二次多項回歸模型為：

2.3.2 回歸模型分析

回歸方差分析見表3。

由表3 可知，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，表明該模型回歸顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義；并且該模型的R2=0.965 1，調(diào)整決定系數(shù)為0.920 1，說明該模型與實際試驗擬合較好，92.01%以上的響應(yīng)值能用所建模型解釋[14]；信噪比13.181遠(yuǎn)大于4，說明信號充足，可應(yīng)用于分析和提取工藝參數(shù)；失擬項p=0.279 8，大于0.05，失擬檢測無顯著性，表明未知因素對試驗干擾較小[15]，具有較高可靠性。模型一次項二次項均達(dá)到較顯著程度，說明試驗的3 個因素對響應(yīng)面值不是簡單的線性關(guān)系[16-18]，且影響多糖得率的因素主次為C＞A＞B，即浸提溫度＞超聲功率＞酶添加量。

表3 回歸方差分析

2.3.3 等高線圖和響應(yīng)曲面

各因素對樺褐孔菌多糖得率影響的三維響應(yīng)面圖見圖7。

由圖7 可知，考查的3 個因素兩兩交互作用均比較顯著[19]。由圖7（a）～（b）可知，當(dāng)浸提溫度為55 ℃時，超聲功率與酶添加量的交互作用對多糖得率的曲面較陡峭，影響顯著；由7（c）～（d）可知，當(dāng)酶添加量為3%時，超聲功率與浸提溫度的交互作用對多糖得率的曲面很陡峭，等高線呈橢圓形，影響顯著；由圖7（e）～（f）可知，當(dāng)超聲功率為300 W 時，酶添加量與浸提溫度的交互作用對多糖得率的曲面較陡峭，影響顯著。

圖7 各因素對樺褐孔菌多糖得率影響的三維響應(yīng)面圖

2.3.4 驗證試驗

利用Box-behnken 設(shè)計對響應(yīng)面試驗結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，試驗預(yù)測的最佳工藝為超聲功率321.46 W，酶添加量3.05%，浸提溫度52.43 ℃，多糖得率4.436%。在實際操作的過程中，將超聲功率調(diào)整為300 W，酶添加量調(diào)整為3%，浸提溫度調(diào)整為55 ℃，進(jìn)行3 次重復(fù)試驗驗證，提取液中多糖得率為4.421%，與理論預(yù)測值較接近，表明響應(yīng)面法優(yōu)化工藝的可靠性較高。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應(yīng)面法試驗優(yōu)化樺褐孔菌多糖的提取工藝，利用Box-behnken 設(shè)計優(yōu)化最佳工藝進(jìn)行驗證試驗，得到其最佳工藝為超聲功率300 W，超聲時間15 min，酶添加量3%，料液比1∶30（g∶mL），浸提溫度55 ℃，在此條件下的多糖得率為4.421%，且試驗重復(fù)性較好。該提取工藝通過纖維素酶和超聲波協(xié)同作用來提高樺褐孔菌多糖的得率，有利于提高樺褐孔菌多糖的利用價值，為樺褐孔菌后續(xù)食品開發(fā)提供試驗依據(jù)。