低鈣血癥奶牛血液代謝指標分析及診斷敏感指標篩選

高昕星，余 昊，史 珍，房志愿，李心慰，杜希良，劉國文

(吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062)

低鈣血癥是圍產(chǎn)期奶牛常發(fā)和群發(fā)的一種營養(yǎng)代謝紊亂性疾病。隨著泌乳的開始，奶牛對鈣的需求提高約65%[1]，然而此時采食量降低、分娩應激等因素導致鈣攝入普遍不足，使機體處于鈣負平衡狀態(tài)，誘發(fā)奶牛臨床低鈣血癥或亞臨床低鈣血癥[2-3]。患病奶牛產(chǎn)奶量下降，還可能并發(fā)一系列其他疾病，如酮病、生產(chǎn)癱瘓、真胃變位、胎衣不下和乳腺炎等[4-5]，嚴重損害奶牛生產(chǎn)性能，給奶牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，高效診斷與監(jiān)測奶牛低鈣血癥至關重要。

低鈣血癥可分為臨床低鈣血癥和亞臨床低鈣血癥。當奶牛血鈣濃度小于1.4 mmol/L，且表現(xiàn)臨床癥狀時，判定奶?；寂R床低鈣血癥。病初奶牛往往興奮不安，食欲明顯減退，精神逐漸低迷，常臥地不起。同時，由于體溫調(diào)節(jié)功能障礙，奶牛體表溫度迅速降低，四肢僵冷。如若不能及時診斷治療，病?？稍?2 h之內(nèi)因呼吸循環(huán)系統(tǒng)衰竭導致窒息死亡[6]；當奶牛血鈣濃度為1.4～2.0 mmol/L，且不表現(xiàn)臨床癥狀時，判定奶?；紒喤R床低鈣血癥。病牛雖未表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但是由于血鈣不足，導致全身肌肉收縮受到抑制，增加了其他生產(chǎn)性和感染性疾病(瘤胃鼓氣、皺胃變位、胎衣不下、子宮內(nèi)膜炎和乳房炎等)的發(fā)病率[7-8]。

迄今為止，除了檢測血鈣濃度，尚無其他有效指標診斷低鈣血癥。值得注意地是，體況評分(body condition score，BCS)和血液生化指標與圍產(chǎn)期奶牛低鈣血癥的患病風險緊密相關。有研究發(fā)現(xiàn)，高BCS(>3.5)的奶?？赡芤虍a(chǎn)后采食量恢復緩慢，而明顯增加低鈣血癥的患病風險[8]。體內(nèi)礦物元素磷(phosphorus，P)、鎂(magnesium，Mg)、鉀(kalium，K)等正常的生理濃度，對維持鈣平衡是十分重要的。例如，血液中P濃度高于2 mmol/L時，奶牛腸道對鈣的吸收能力會受到顯著地抑制[9]，從而誘發(fā)低鈣血癥。此外，圍產(chǎn)期奶牛存在能量代謝紊亂和系統(tǒng)性炎癥反應，并伴隨不同程度的肝損傷[10]。然而，低鈣血癥奶牛血液礦物元素代謝，能量代謝和炎癥反應相關指標與血鈣濃度的相關性尚不清楚，這些指標是否可以作為診斷低鈣血癥的輔助指標也有待確定。因此，本試驗通過分析與比較圍產(chǎn)期健康奶牛與臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛血液中礦物元素代謝，能量代謝和炎癥反應相關指標的差異及各指標與血鈣濃度的相關性，旨在明確低鈣血癥奶牛代謝特征并篩選診斷低鈣血癥的敏感指標，為規(guī)?；翀龈咝г\斷和監(jiān)測低鈣血癥提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用的荷斯坦奶牛均來自吉林省長春市廣澤奶牛場。動物使用方案經(jīng)吉林大學動物使用與護理倫理委員會批準。首先，我們對所有的奶牛都進行了常規(guī)體檢，以確保沒有其他并發(fā)癥。然后挑選產(chǎn)后1周內(nèi)新產(chǎn)母牛作為低鈣血癥奶牛的初篩對象。并根據(jù)血液相關參數(shù)，獲得100頭血鈣較低的奶牛。根據(jù)血鈣濃度(總血鈣1.4～2.0 mmol/L)和臨床表現(xiàn)(無異常表現(xiàn))，判定出20頭亞臨床低鈣血癥奶牛[11]；血鈣濃度(總血鈣<1.4 mmol/L)和臨床表現(xiàn)(上述臨床低鈣血癥主要癥狀)，判定20頭臨床低鈣血癥奶牛；另外，根據(jù)總血鈣濃度(2.1～2.5 mmol/L)和臨床指征(包括呼吸、脈搏和體溫等正常)，判定20頭健康對照奶牛[12]。試驗選擇的所有奶牛均在相同條件的牛棚中，自由采食一樣的飼料。奶牛BCS、產(chǎn)奶量和干物質(zhì)攝入量(dry matter intake，DMI)見表1。

1.2 樣品采集在清晨飼喂前連續(xù)3 d經(jīng)頸靜脈無菌采集健康、臨床和亞臨床低鈣血癥奶牛的血液樣品各20 mL。分裝10 mL用肝素鈉抗凝處理以便分離血漿，剩余10 mL不做抗凝處理用于分離血清。3 800 r/min離心10 min，將收集到的血漿(或血清)分裝于1.5 mL離心管中，標記后保存于-80℃直到用于后續(xù)檢測分析。

1.3 主要試劑血液樣品中鈣(calcium，Ca)、K、P、Mg、鈉(natrium，Na)、葡萄糖(glucose，Glu)、非酯化脂肪酸(non-esterified，NEFA)、β-羥丁酸(β-hydroxybutyric，BHBA)和甘油三酯(triglyceride，TG)檢測試劑盒購自Roche公司，用HITACHI 7170全自動生化分析儀檢測；天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine amiotransferase，ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyl transpeptidase，GGT)檢測試劑盒購自Roche公司；白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、觸珠蛋白(haptoglobin，HP)和淀粉樣蛋白A(serum amyloid A protein，SAA)檢測試劑盒購自CUSABIO公司。

2 結果

2.1 臨床、亞臨床低鈣血癥與健康奶牛臨床基礎指標的比較如表1所示，臨床低鈣血癥奶牛、亞臨床低鈣血癥奶牛的BCS顯著高于健康奶牛，且臨床低鈣血癥奶牛的BCS高于亞臨床低鈣血癥奶牛；臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛的產(chǎn)奶量均顯著低于健康奶牛，且臨床低鈣血癥奶牛產(chǎn)奶量更低。此外，臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛的DMI均顯著低于健康奶牛。說明BCS較高的奶牛低鈣血癥的發(fā)病率更高。

表1 健康奶牛與臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛臨床基礎指標比較(n=20)

2.2 臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛和健康奶牛礦物元素及其與血鈣濃度相關性分析結果如表2所示，與健康奶牛相比，臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛血液中Ca、K、Na和Mg濃度均顯著降低(P<0.05)。P濃度與血鈣呈顯著負相關(P<0.05)，血液中K、Na和Mg濃度與血鈣均呈顯著正相關(P<0.05)。說明臨床與亞臨床低鈣血癥奶牛都存在礦物代謝紊亂。

表2 健康奶牛與臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛礦物元素相關指標及其與 Ca 濃度相分析結果(n=20) mmol/L

2.3 臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛和健康奶牛能量代謝相關指標及其與血鈣濃度相關性分析結果如表3所示，與健康奶牛相比，臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛血液中NEFA、BHBA濃度顯著升高(P<0.05)，而Glu水平均低于健康奶牛。NEFA、BHBA濃度與血鈣呈顯著負相關(P<0.05)，Glu濃度與血鈣呈顯著正相關(P<0.05)，TG濃度與血鈣無顯著相關性。以上結果表明，臨床與亞臨床低鈣血癥奶牛均存在能量代謝紊亂。

表3 健康奶牛與臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛能量代謝相關指標及其與Ca濃度相關性分析結果(n= 20) mmol/L

2.4 臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛和健康奶牛肝功能相關指標及其與血鈣濃度相關性分析結果如表4所示，檢測臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛的肝損傷指標，發(fā)現(xiàn)臨床低鈣血癥奶牛和亞臨床低鈣血癥奶牛血液中AST活性、ALT活性和GGT活性顯著高于健康奶牛(P<0.05)；臨床低鈣血癥奶牛血液中的ALP活性顯著低于健康奶牛(P<0.05)；亞臨床低鈣血癥奶牛血液中的ALP活性與健康奶牛無顯著差異，臨床低鈣血癥奶牛血液中的GGT活性與亞臨床低鈣血癥奶牛無顯著差異。臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛血液中的AST活性、ALT活性和GGT活性與血鈣濃度呈顯著負相關(P<0.05)；臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛血液中的ALP活性與血鈣濃度無顯著相關性。以上結果表明臨床和亞臨床低鈣血癥奶牛都存在肝損傷，但臨床低鈣血癥奶牛的肝損傷程度更加嚴重。

表4 健康奶牛與臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛肝功能相關指標及其與Ca濃度相關性分析結果(n=20) U/L

2.5 臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛和健康奶牛炎性相關指標及其與血鈣濃度相關性分析結果如表5所示，臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛血液中IL-1β、IL-6、HP和TNF-α濃度均顯著高于健康奶牛(P<0.05)，臨床低鈣血癥奶牛血液中的SAA濃度顯著高于亞臨床低鈣血癥奶牛和健康奶牛；且IL-1β、IL-6、HP和SAA濃度與血鈣濃度呈顯著負相關(P<0.05)，IL-2濃度與血鈣濃度呈顯著正相關(P<0.05)。該結果表明，低鈣血癥發(fā)生時，機體存在系統(tǒng)性炎癥，這些促炎因子在臨床低鈣血癥奶牛中高于亞臨床低鈣血癥，說明臨床低鈣血癥奶牛的炎性水平更高。

表5 健康奶牛與臨床、亞臨床低鈣血癥奶牛炎性相關指標及其與Ca濃度相關性分析結果(n= 20)

3 討論

低鈣血癥是圍產(chǎn)期奶牛常見的營養(yǎng)代謝紊亂性疾病[3]，其發(fā)生與產(chǎn)犢前后鈣代謝失衡有關。盡管目前已經(jīng)將低于2.0 mmol/L的血鈣濃度并伴有典型的臨床體征作為診斷低鈣血癥的金標準，但由于亞臨床低鈣血癥奶牛往往不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀且在牧場很難實施相對復雜的鈣離子測定過程，使得更為常見的奶牛亞臨床低鈣血癥的及時確診和有效治療十分困難。近期多項研究表明，鈣磷代謝紊亂是引起圍產(chǎn)期奶牛其他代謝紊亂性疾病(如酮病和脂肪肝)和感染性疾病(如乳腺炎和子宮內(nèi)膜炎)的重要誘發(fā)因素[13]。因此，本研究比較分析了臨床和亞臨床低鈣血癥奶牛血液的礦物元素(Ca、Mg、Na、K和P)、能量代謝指標(Glu、NEFA、BHBA和TG)、肝損傷指標(ALT和AST、ALP和GGT)和炎性相關指標(IL-1、IL-2、IL-6、HP、SAA和TNF-α)的變化特征及其與血鈣濃度的相關性并篩選了診斷低鈣血癥的敏感指標。結果發(fā)現(xiàn)，亞臨床和臨床低鈣血癥奶牛均表現(xiàn)為血鈣濃度下降，且血液中P、NEFA、BHBA、IL-1β、IL-6、HP和SAA濃度與血清鈣呈顯著負相關(P<0.05)，血液中K、Na和Mg、Glu和IL-2濃度與血鈣均呈顯著正相關(P<0.05)，可以作為低鈣血癥的輔助診斷指標。這些結果為確定潛在的敏感低鈣血癥生物標志物提供了數(shù)據(jù)支撐。

鈣缺失是低鈣血癥的主要特征，除了與泌乳啟動消耗大量鈣相關外，還受產(chǎn)后初期奶牛DMI攝入不足導致的鈣供給受限影響。充足的血鈣對于維持動物健康是至關重要的[14]。圍產(chǎn)期奶牛由于激素水平改變以及胎兒成長壓迫瘤胃導致食欲下降，從而降低外界鈣攝入及能量供應。而此時奶牛應對產(chǎn)犢、泌乳啟動等過程需要大量能量，導致血糖水平迅速降低，使得機體啟動脂肪動員，增加了酮病的發(fā)病風險[15-16]。NEFA和BHBA作為機體脂肪動員的產(chǎn)物，能準確反映機體的能量缺乏狀態(tài)。由于外源鈣和能量供應均從飲食中獲得，因此監(jiān)測能量缺乏狀態(tài)可能反映鈣的攝入量。此外，血鈣濃度降低減緩胃腸蠕動，降低飼料的能量轉化效率，從而加劇能量代謝紊亂，這進一步說明血鈣濃度與能量代謝狀態(tài)密切相關[17]。本研究發(fā)現(xiàn)臨床和亞臨床低鈣血癥奶牛血液中Glu水平低于正常奶牛，而NEFA和BHBA濃度水平顯著高于正常奶牛，這表明亞臨床和臨床低鈣血癥奶牛處于能量負平衡狀態(tài)；且Glu與血鈣濃度呈顯著正相關，NEFA和BHBA與血鈣濃度呈顯著負相關，這些能量代謝指標在一定程度上反映了機體的血鈣水平，可以作為敏感指標來幫助我們診斷奶牛低鈣血癥。

除了增加腸鈣吸收以外，機體還能通過迅速動員骨鈣，并增加腎臟對鈣的重吸收以保證泌乳早期的鈣穩(wěn)態(tài)。這一過程受多種酶和內(nèi)分泌激素調(diào)控，例如甲狀旁腺素(PTH)。PTH不僅能增加腸鈣吸收，還能通過促進骨和腎臟對鈣的重吸收以增加血鈣濃度[18]。研究表明，PTH的促血鈣升高作用受多種礦物元素的調(diào)控，包括磷、鎂和鉀等[8]。高水平的血磷濃度能通過減弱PTH誘導的1,25(OH)2D3生成，抑制腸鈣吸收和腎臟及骨鈣的重吸收；低水平的血鎂濃度能改變PTH受體的構象而使PTH的升鈣作用鈍化[2]；高水平的血鉀能降低瘤胃上皮對鎂的轉運，使鎂攝入受限，從而影響鈣代謝。此外，低血鉀還能通過降低奶牛DMI減少日糧中的鈣攝入。這些都表明礦物元素磷、鎂和鉀的血液水平均能反映機體的鈣代謝狀態(tài)。本研究顯示，亞臨床和臨床低鈣血癥奶牛血液中鎂濃度和鉀濃度顯著低于健康奶牛，而磷濃度顯著高于健康奶牛，且均與血鈣濃度呈現(xiàn)顯著相關性，可見高磷、低鎂和低鉀可作為診斷評估低鈣血癥的敏感指標。

鈣離子作為細胞內(nèi)的重要信號分子，維持細胞的生理功能，參與中性粒細胞的形成、釋放、凋亡、黏附的調(diào)控[19]。圍產(chǎn)期奶牛機體內(nèi)的低鈣水平使得奶牛因生理狀態(tài)改變和能量代謝紊亂誘導的炎性反應無法得到有效緩解[20]。而炎癥反應的持續(xù)存在會促進骨質(zhì)流失，進一步降低體內(nèi)鈣水平，形成惡性循環(huán)。單核因子是一類促炎細胞因子，參與炎癥調(diào)節(jié)的關鍵步驟[21]。在骨質(zhì)流失的進程中，機體受到刺激，單核細胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α和IL-8參與調(diào)節(jié)[22-23]。有研究顯示，低鈣血癥奶牛從產(chǎn)前4周至產(chǎn)后4周持續(xù)存在高濃度TNF-α[23]，說明低鈣血癥奶牛存在系統(tǒng)性炎癥。與此相一致，在我們的研究中也發(fā)現(xiàn)亞臨床和臨床低鈣血癥奶牛血液中TNF-α的濃度顯著高于健康奶牛。更重要的是，還發(fā)現(xiàn)顯著增高的IL-1β、IL-6、HP和SAA水平，且這些指標均與血鈣濃度呈現(xiàn)顯著負相關。這表明低鈣血癥奶牛存在系統(tǒng)性炎癥，且高濃度的IL-1β、IL-6、TNF-α、HP和SAA可側面表征機體的血鈣匱乏狀態(tài)。IL-2水平出現(xiàn)降低，這可能與奶牛體內(nèi)的1,25(OH)2D3的代謝有關，但具體機制還需要進一步研究。

此外，低鈣血癥奶牛還易患酮癥和脂肪肝等以肝損傷為病理特征的能量代謝性疾病[24]。ALT和AST是評估肝細胞損傷的最常見指標，分別反映肝細胞完整性和損傷嚴重程度。本研究發(fā)現(xiàn)臨床低鈣血癥奶牛血液中AST活性、ALT活性、GGT活性顯著高于健康奶牛，并且AST活性與血鈣濃度之間也具有顯著相關性，但ALP活性與血鈣濃度之間無顯著差異。AST活性升高表明低鈣血癥奶牛存在肝損傷[25]，但這種肝損傷與血鈣濃度下降之間是否存在緊密聯(lián)系仍無法確定。因此，肝損傷指標能否作為判斷奶牛低鈣血癥的敏感指標還需要進一步研究。。

綜上，亞臨床和臨床低鈣血癥奶牛存在礦物元素水平改變、能量代謝紊亂、炎性反應和肝損傷。更重要的是，奶牛血液中礦物元素(Mg、Na、K和P)濃度、能量代謝指標(Glu、NEFA和BHBA)狀態(tài)和炎性因子(IL-1、IL-2、IL-6、HP、SAA和TNF-α)水平均與血鈣濃度顯著相關，這指示著它們可以作為聯(lián)合敏感指標表征奶牛低鈣血癥。