17β-雌二醇抑制LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)及其作用機(jī)制

余紫薇，王曉杜，羅通旺，姜 勝，巴少波，王 磊，宋泉江，周 彬，宋厚輝，邵春艷

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院/動物醫(yī)學(xué)院，浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術(shù)浙江省工程研究中心/浙江省動物醫(yī)學(xué)與健康管理國際科技合作基地/中澳動物健康大數(shù)據(jù)分析聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 311300)

子宮內(nèi)膜炎是一種常發(fā)生于奶畜產(chǎn)后的生殖系統(tǒng)疾病，可引起奶畜子宮復(fù)舊不全、產(chǎn)奶量下降、受孕率降低甚至不孕，發(fā)病率高達(dá) 10%～20%，嚴(yán)重影響奶畜的生產(chǎn)性能，給奶畜養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎發(fā)生最直接的原因是病原微生物感染，但同時也受機(jī)體性激素周期性變化的影響[4-7]。大量研究顯示，當(dāng)奶畜機(jī)體雌激素水平降低時，更易感染子宮內(nèi)膜炎[8-10]。研究顯示，雌激素不僅對生殖系統(tǒng)有不可缺少的作用，對免疫系統(tǒng)也有重要的調(diào)節(jié)作用[11-13]。17β-雌二醇(17β-E2)是一種甾體雌激素，是雌性動物生殖階段最主要的性激素[14]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，具有很強(qiáng)的致炎活性，能誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子不同程度表達(dá)，在體外試驗(yàn)中常用于誘導(dǎo)不同細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型[15-16]。截止目前，關(guān)于雌激素對子宮內(nèi)膜炎的保護(hù)作用及其作用機(jī)理還不甚明確。因此本試驗(yàn)首先添加17β-E2進(jìn)行預(yù)處理，再以LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7細(xì)胞炎癥，通過測定細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-18和NLRP3 mRNA的表達(dá)量和細(xì)胞內(nèi)及上清中IL-1β的蛋白表達(dá)量，探究17β-E2對Raw264.7細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用，并研究其對炎癥通路NF-κB信號通路相關(guān)因子蛋白水平的調(diào)控，以期揭示17β-E2抑制LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞炎癥機(jī)制，為奶畜子宮內(nèi)膜炎的防控與治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑細(xì)胞株小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；17β-E2、PHTPP(ERβ抑制劑)、LPS(O111:B4)和5′-三磷酸腺苷(ATP)購自Sigma公司；ICI 182 780(ER抑制劑)購自Abcam公司；DMEM培養(yǎng)基、無血清無酚紅培養(yǎng)基、PBS(pH7.2)、0.25% Trypsin-EDTA和雙抗購自Gibco公司；IL-1β檢測試劑盒購自RD公司；抗體p-IκBα、IκBα、PARP、IL-1β和NF-κB p65購自CST公司；MPP(ERα抑制劑)和anti-β-actin購自Santa Cruz公司；qRT-PCR熒光定量檢測試劑盒購自TaKaRa公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器超凈操作臺(蘇州凈化)；移液槍(Eppendorf)；電動移液器(Bio-Rad)；超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝)；蛋白電泳儀(Bio-Rad)；臺式高速冷凍離心機(jī)(Beckman)；多功能酶標(biāo)儀(Bio Tek)；制冰機(jī)(寧波格蘭特)。

1.3 LPS最佳作用濃度及時間的篩選Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，待細(xì)胞長滿后用0.25% Trypsin-EDTA消化，調(diào)整細(xì)胞密度為6.5×106個/L，200 μL/孔接種至96孔細(xì)胞板，待細(xì)胞長至80%左右時，分別向細(xì)胞上清中添加LPS，其終質(zhì)量濃度分別為0，1，10，100和1 000 μg/L，在收集細(xì)胞前30 min再加入ATP(終濃度5 mmol/L)，分別于LPS刺激后1，2，4和8 h收集細(xì)胞，用于TLR4、IL-1β和IL-18 mRNA水平檢測。

1.4 17β-E2預(yù)處理及細(xì)胞分組為研究17β-E2對細(xì)胞炎癥的作用效果，在Raw264.7細(xì)胞長至80%左右時，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無血清無酚紅培養(yǎng)基。先向細(xì)胞中加入17β-E2(終濃度100 nmol/L)孵育24 h，再加入LPS(終質(zhì)量濃度1 000 μg/L)作用4 h，在收集細(xì)胞前30 min再加入ATP(終濃度5 mmol/L)。為研究雌激素受體及其亞型對17β-E2的抑制效果，在加入17β-E2前30 min先分別加入ICI 182 780/MPP/PHTPP(終濃度均為250 nmol/L)，再依次加入17β-E2、LPS和ATP，并分別設(shè)置空白組(Mock)、對照組(DMSO)、LPS組和E2/ICI 182 780/MPP/PHTPP單獨(dú)對照組。

1.5 qRT-PCR法檢測Raw264.7相關(guān)因子mRNA表達(dá)根據(jù)試驗(yàn)分組，收集各組細(xì)胞，加入TRNzol裂解液提取細(xì)胞RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用實(shí)時熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測。用DNAStar與Beacon Designer軟件設(shè)計引物，TLR4、IL-1β、IL-18、NLRP3和β-actin具體引物序列見表1，所用引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。各組細(xì)胞分別設(shè)置3個復(fù)孔，記錄各孔Ct值，采用分析2-△△Ct法對結(jié)果進(jìn)行。

表1 引物序列

1.6 Western blot法檢測Raw264.7相關(guān)蛋白表達(dá)根據(jù)試驗(yàn)分組，收集各組細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液及1%蛋白酶抑制劑，冰上吹打后超聲，4℃，12 000 r/min 離心15 min后取上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。上樣量為20 μg，制膠后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜3次，分別用IL-1β、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα、PARP、β-actin一抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次。滴加ECL顯色液顯影拍照，并用Image J軟件對各蛋白表達(dá)情況進(jìn)行灰度值分析。

1.7 ELISA法檢測Raw264.7細(xì)胞上清中IL-1β含量根據(jù)試驗(yàn)分組，收集各組細(xì)胞上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組細(xì)胞上清中IL-1β含量變化，按照試劑盒說明書開展試驗(yàn)，用酶標(biāo)儀測定各組吸光度。

1.8 細(xì)胞免疫熒光法檢測NF-κB p65在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位按上述分組進(jìn)行制備細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛固定爬片15 min，0.5% Triton X-100室溫通透20 min 1% BSA室溫封閉30 min。移除封閉液，每張爬片滴加1∶400稀釋的一抗，4℃孵育過夜，PBST 清洗爬片3次，移除多余液體后滴加1∶500 稀釋的熒光二抗，37℃孵育1 h。PBST清洗爬片3次，滴加1∶1 000稀釋的DAPI避光37℃孵育5 min，封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 LPS對Raw264.7細(xì)胞炎性相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響以不同質(zhì)量濃度LPS分別作用Raw264.7不同的時間，通過qRT-PCR法檢測Raw264.7細(xì)胞中TLR4、IL-1β和IL-18 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖1所示，與Mock組相比， 1 000 μg/L濃度的LPS作用Raw264.7細(xì)胞4 h時，TLR4、IL-1β、IL-18 mRNA表達(dá)均極顯著提高(P<0.01)。因此后續(xù)試驗(yàn)選取1 000 μg/L的LPS作用Raw264.7細(xì)胞4 h為本試驗(yàn)的體外研究細(xì)胞炎癥模型。

2.2 17β-E2對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞TLR4及炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響為研究17β-E2對炎癥反應(yīng)的影響，通過qRT-PCR法檢測Raw264.7細(xì)胞中TLR4、IL-1β、IL-18和NLRP3 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖2顯示，與Mock組相比，DMSO處理對細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)無明顯影響。LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞后4 h，TLR4的mRNA水平顯著提高(P<0.05)，IL-1β、IL-18、NLRP3 mRNA表達(dá)極顯著提高(P<0.01)。與LPS組相比， E2+LPS共處理組TLR4、IL-1β 、IL-18和NLRP3 mRNA表達(dá)均降低，差異顯著(P<0.05)。

與Mock組相比，*P<0.05，**P<0.01；與LPS組相比，#P<0.05，##P<0.01。下同

2.3 17β-E2對LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞中IL-1β蛋白表達(dá)量的影響為驗(yàn)證17β-E2對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，首先向Raw264.7細(xì)胞中添加終濃度為250 nmol/L的雌激素受體抑制劑ICI 182 780孵育30 min，再依次加入17β-E2、LPS和ATP，分別收集細(xì)胞上清和沉淀，用WB和ELISA法檢測各組IL-1β的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示，與Mock組相比，E2處理組IL-1β細(xì)胞上清和沉淀中蛋白表達(dá)水平均無顯著變化(P>0.05)，LPS處理極顯著提高IL-1β蛋白表達(dá)水平(P<0.01)。與LPS組相比，E2+LPS組細(xì)胞和上清中IL-1β蛋白表達(dá)量均下降，差異極顯著(P<0.01)，而ICI 182 780+E2+LPS組細(xì)胞中IL-1β蛋白表達(dá)量與LPS組相比則無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 17β-E2對LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞中IL-1β蛋白表達(dá)量的影響

2.4 17β-E2對LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞中p-IκBα和NF-κB p65表達(dá)的影響為進(jìn)一步探究17β-E2抑制LPS引起的細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，分別收集各組細(xì)胞沉淀抽提細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白，用WB方法分別檢測細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65，細(xì)胞漿中NF-κB p65、p-IκBα和IκBα的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖4所示，與Mock組相比，LPS處理極顯著提高了細(xì)胞核中NF-κB p65的蛋白表達(dá)量(P<0.01)，E2處理細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)量和細(xì)胞漿中p-IκBα水平均無明顯變化(P>0.05)。與LPS組相比， E2+LPS組細(xì)胞核中NF-κB p65的蛋白表達(dá)量和細(xì)胞漿中p-IκBα水平均極顯著下降(P<0.01)。

圖4 17β-E2對LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞中p-IκBα和NF-κB p65表達(dá)的影響

2.5 17β-E2對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65表達(dá)量的變化為進(jìn)一步探究17β-E2發(fā)揮抗炎作用的ER亞型，分別使用ERα和ERβ拮抗劑進(jìn)行試驗(yàn)。首先向Raw264.7細(xì)胞中分別添加終濃度為250 nmol/L的ER抑制劑ICI 182 780，ERα的選擇性拮抗劑MPP，ERβ的選擇性拮抗劑PHTPP，孵育30 min，而后再依次加入17β-E2、LPS和ATP。用免疫熒光法觀察NF-κB p65在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量和定位情況。結(jié)果如圖5所示，與Mock組相比，LPS處理組NF-κB p65在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)量急劇升高，E2+LPS組p65多在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有表達(dá)，ICI182 780+E2+LPS組NF-κB p65在細(xì)胞核中的表達(dá)量再次升高，MPP+E2+LPS組NF-κB p65主要在細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá)，PHTPP+E2+LPS組NF-κB p65在細(xì)胞核中的表達(dá)量較高。

圖5 17β-E2對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65表達(dá)量的變化(6 400×)

3 討論

雌激素是主要是由卵巢的卵泡分泌的一種類固醇激素，主要包括雌酮、雌二醇和雌三醇等，其中雌二醇(17β-E2)的生物活性最強(qiáng)。除了促進(jìn)雌性生殖系統(tǒng)生長發(fā)育外，雌激素還參與細(xì)胞的生長、分化、免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等，還與自身免疫性疾病密切相關(guān)[17-21]。在人醫(yī)領(lǐng)域，廣泛采用雌激素聯(lián)合甲硝唑治療絕經(jīng)后老年性陰道炎，療效顯著[22]。但截止目前，雌激素抗炎作用的具體機(jī)制尚不清楚[4]。本試驗(yàn)采用質(zhì)量濃度1 000 μg/L的LPS作用Raw264.7細(xì)胞4 h，構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型來探討17β-E2對LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，從mRNA表達(dá)水平上看，與Mock組相比，LPS處理后細(xì)胞IL-1β、IL-18、NLRP3表達(dá)極顯著提高(P<0.01)，TLR4表達(dá)提高(P<0.05)，與LPS組相比，E2+LPS處理組極顯著抑制了IL-1β 、IL-18和NLRP3表達(dá)(P<0.01)，顯著降低了TLR4表達(dá)(P<0.05)，這與張莉莉等[23]的研究結(jié)果一致。從蛋白表達(dá)水平上看，與Mock組相比，LPS處理極顯著提高細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞上清中IL-1β水平(P<0.01)，與LPS組相比，E2+LPS組細(xì)胞內(nèi)和上清中IL-1β蛋白表達(dá)量均極顯著下降(P<0.01)。而ICI 182 780+E2+LPS組細(xì)胞上清中IL-1β蛋白表達(dá)量提高(P<0.05)。結(jié)果表明17β-E2可抑制LPS引起的細(xì)胞炎癥反應(yīng)，而ICI 182 780又可以拮抗E2的炎癥抑制反應(yīng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了17β-E2的抗炎作用。

核因子kappa B(NF-κB)家族的轉(zhuǎn)錄因子是免疫發(fā)育、免疫反應(yīng)、炎癥和癌癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[24-25]。NF-κB家族主要成員包括p65和p50，正常生理情況下，兩者以異二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到炎癥等刺激因素時，NF-κB通路被激活，p65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，進(jìn)而促進(jìn)促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放[26-28]。在本試驗(yàn)中，通過分離細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白，用WB方法分別檢測細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65以及細(xì)胞漿中NF-κB p65、p-IκBα、IκBα的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與Mock組相比，LPS處理極顯著提高了細(xì)胞核中NF-κB p65的蛋白表達(dá)量(P<0.01)，與LPS處理組相比，E2+LPS組細(xì)胞核中NF-κB p65的蛋白表達(dá)量和細(xì)胞漿中IκBα的磷酸化水平均極顯著下降(P<0.01)。

雌激素受體(ER)是雌激素作用的關(guān)鍵配體，其與雌激素結(jié)合后可調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，其主要包括兩種亞型ERα和ERβ[29]。研究顯示，患有子宮內(nèi)膜炎母犬和母馬中，子宮腺中ER表達(dá)量均顯著低于正常母犬和母馬[4,30]。本試驗(yàn)分別通過添加ER、ERα和ERβ拮抗劑的方式，觀察17β-E2對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65入核的變化。結(jié)果顯示，LPS處理組NF-κB p65在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)量急劇升高，E2+LPS組p65多在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有表達(dá)，加入ERβ的選擇性拮抗劑PHTPP后，p65在細(xì)胞核中的表達(dá)量較高，而加入ERα選擇性拮抗劑MPP，p65仍主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。這表明雌激素主要通過與ERβ結(jié)合后，抑制NF-κB p65進(jìn)入細(xì)胞核和抑制IκBα磷酸化的水平，從而抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

綜上所述，17β-E2對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過與雌激素受體ERβ結(jié)合介導(dǎo)NF-κB 信號通路，進(jìn)而抑制促炎因子IL-1β的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。