布魯菌M5疫苗株感染對(duì)宿主細(xì)胞自噬溶酶體途徑的影響

楊寧寧，張 倩，易繼海，王 震*，陳創(chuàng)夫*

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000；2.西部地區(qū)高發(fā)人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，新疆 石河子 832000；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832000)

自噬是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中高度保守的細(xì)胞內(nèi)降解過程[1]。通過自噬作用，細(xì)胞質(zhì)里的物質(zhì)被自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)所包裹，通過與溶酶體融合形成自噬溶酶體，胞質(zhì)里的物質(zhì)就被溶酶體所降解[2]。按照細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送至溶酶體的方式的差異可將自噬分為3類，即：微自噬、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，一般情況下“巨自噬”即常稱為自噬[3]。自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene,Atg)是細(xì)胞自噬的重要調(diào)節(jié)點(diǎn)[4-5]。目前僅有微管相關(guān)蛋白輕鏈 3 (microtubule-associated protein light chain 3，LC3)參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬發(fā)生的整個(gè)過程，因此可作為細(xì)胞自噬過程中的重要標(biāo)志之一[6-8]。 LC3在細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式，即：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，由于 LC3-Ⅱ參與自噬體膜形成的始終，因此，細(xì)胞中 LC3-Ⅱ的含量在一定程度上反映了該細(xì)胞的自噬程度[9-11]。

研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)病原微生物(細(xì)菌、病毒等)可通過自噬調(diào)控其在胞內(nèi)的復(fù)制過程，一方面，自噬可以降解殺滅入侵的病原微生物，清除胞內(nèi)病原體，維持機(jī)體的自身穩(wěn)定；另一方面，自噬可被一些病原微生物所利用，促進(jìn)其對(duì)宿主的感染，起到損傷宿主細(xì)胞作用[12-16]。本課題組前期的研究表明可以用綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒 pWal-GFP電轉(zhuǎn)化布魯菌(Brucella),再將轉(zhuǎn)化后的pWal-GFP-Brucella侵染已經(jīng)標(biāo)記溶酶體紅色熒光探針(Lyso-Tracker Red)的RAW264.7細(xì)胞，用激光共聚焦顯微鏡觀察布魯菌和溶酶體共定位，由于沒有穩(wěn)定的細(xì)胞系，導(dǎo)致操作比較繁瑣，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，且很難開展后續(xù)工作[17]。隨后本課題組又構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) GFP-LC3 的RAW264.7 細(xì)胞株[18]。但隨著自噬進(jìn)程的發(fā)展，GFP在酸性條件下會(huì)發(fā)生淬滅，不利于觀察自噬溶酶體。mCherry以及其他大多數(shù)紅色熒光蛋白都是從珊瑚中分離出來的，因其顏色和單體分子的光穩(wěn)定性，比其他熒光蛋白標(biāo)簽更優(yōu)異，可以補(bǔ)償 GFP 的不足，mCherry-GFP-LC3Ⅱ 融合蛋白優(yōu)于 GFP-LC3 融合蛋白。本試驗(yàn)旨在設(shè)計(jì)含有 mCherry-GFP-LC3Ⅱ 目的基因的重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒感染和嘌呤霉素抗性篩選得到純度較高的能夠穩(wěn)定表達(dá)mCherry-GFP-LC3Ⅱ 融合蛋白的RAW264.7細(xì)胞株，并對(duì)布魯菌M5疫苗株與自噬的關(guān)系進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料RAW264.7細(xì)胞和293T細(xì)胞購自北納生物公司；胎牛血清購自Gibco公司；pMD2.G 包裝質(zhì)粒和pspa×2.0 包裝質(zhì)粒購自權(quán)陽生物公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；LipofectamineTM2000購自賽默飛世爾科技公司；4%多聚甲醛固定液購自武漢博士德生物工程有限公司；聚凝胺(polybrene)、嘌呤霉素(puromycin)、雷帕霉素(rapamycin)和氨芐西林(ampicillin)均購自北京索萊寶科技有限公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司。

1.2 方法

1.2.1mCherry-GFP-LC3Ⅱ 質(zhì)粒的合成及驗(yàn)證 根據(jù)需求將含有 mCherry、GFP 和 LC3 Ⅱ基因的質(zhì)粒序列送權(quán)陽生物公司進(jìn)行合成。將合成的 mCherry-GFP-LC3Ⅱ 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含ampicillin抗性的 LB 固體培養(yǎng)板上，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日挑取單個(gè)克隆恒溫?fù)u床培養(yǎng) 2 h，送至上海生工有限公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，恒溫?fù)u床培養(yǎng) 6 h，甘油和菌1∶1的比例進(jìn)行保菌。按照天根無內(nèi)毒素大提試劑盒說明書操作步驟提取mCherry-GFP-LC3Ⅱ的質(zhì)粒，并測定其濃度。

1.2.2慢病毒的包裝和濃縮 用含有10%胎牛血清的 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng) 293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1 d，將 293T 細(xì)胞傳代至 10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞用 PBS 漂洗 3 次，換為無血清的 DMEM 完全培養(yǎng)液。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中平衡1 h，按照 LipofectamineTM2000 操作說明書， 將質(zhì)粒 pMD2.G、pspa×2.0、mCherry-GFP-LC3Ⅱ 按 1∶1∶1 的比例共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞。48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染效率，并分別于轉(zhuǎn)染后48，72 h收集細(xì)胞上清，用 0.45 μm 的濾膜過濾后用超濾管中進(jìn)行濃縮，凍存于-80℃冰箱。注意避免反復(fù)凍融，否則會(huì)影響病毒的滴度。

1.2.3穩(wěn)定表達(dá)mCherry-GFP-LC3Ⅱ 的 RAW264.7細(xì)胞株的構(gòu)建及篩選 將狀態(tài)良好的 RAW264.7 細(xì)胞接種到 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為 1×105個(gè)。感染前，從-80℃冰箱取出病毒并在冰上緩慢融化，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用 PBS 漂洗 3 次，將病毒原液與 1/2 體積新鮮培養(yǎng)液混勻加入細(xì)胞中，并加入 8 mg/L polybrene 用以提高感染效率。感染后 5 h 補(bǔ)齊培養(yǎng)液至正常體積，并于感染后 24 h 換液，繼續(xù)37℃、5% CO2培養(yǎng)。感染后 48 h，可通過倒置熒光顯微鏡觀察 mCherry 和 GFP 的感染效率。72 h 后換含有 2 mg/L 的 puromycin新鮮完全培養(yǎng)液，篩選穩(wěn)定傳代的細(xì)胞株。

1.2.4自噬模型的驗(yàn)證 將獲得的mCherry-GFP-LC3Ⅱ-RAW246.7細(xì)胞株以1×105個(gè)/孔均勻地鋪于激光共聚焦細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分別加入 rapamycin (100 nmol/L)、 DMSO (1/10 000)和 EBSS(2 mL)饑餓培養(yǎng)液處理4 h，PBS 漂洗 3 次后，加入 4%多聚甲醛固定液室溫固定 15 min。吸棄固定液，PBS 漂洗 3 次，加入 200 μL PBS 使細(xì)胞保持濕潤，在激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬進(jìn)程并照相，對(duì) mCherry-GFP-LC3Ⅱ 的陽性點(diǎn)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5布魯菌M5疫苗株侵染后自噬特異性標(biāo)簽 mCherry-GFP-LC3Ⅱ puncta 的分布 將獲得的mCherry-GFP-LC3Ⅱ-RAW246.7細(xì)胞株以1×105個(gè)/孔均勻地鋪于激光共聚焦細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分別加入M5疫苗株(MOI=100)、rapamycin (100 nmol/L)和 DMSO(1/10 000)處理細(xì)胞 4 h，PBS 漂洗 3 次，加入 4%多聚甲醛固定液室溫固定細(xì)胞 15 min。吸棄固定液，PBS 漂洗 3 次，加入 200 μL PBS 使細(xì)胞保持濕潤，激光共聚焦顯微鏡觀察并照相，對(duì) mCherry-GFP-LC3Ⅱ 的陽性點(diǎn)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒的包裝及濃縮慢病毒包裝質(zhì)粒(mCherry-GFP-LC3Ⅱ、pMD2.G 和 pspa×2.0)共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞后 24 h， 在倒置熒光顯微鏡(明場)觀察發(fā)現(xiàn) 293T 細(xì)胞生成狀態(tài)良好，且高效表達(dá) mCherry 和 GFP 熒光(圖 1)，說明慢病毒包裝成功。收集細(xì)胞上清中的病毒進(jìn)行濃縮，檢測其病毒滴度為 1×109TU/mL。

圖1 倒置熒光顯微鏡下 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果及 mCherry 和 GFP 在 mCherry-GFPLC3Ⅱ-RAW246.7 細(xì)胞中的表達(dá)(200×)

2.2 mCherry-GFP-LC3Ⅱ-RAW246.7 細(xì)胞株的構(gòu)建及篩選濃縮的病毒與 RAW246.7 細(xì)胞共孵育48 h 后，通過倒置熒光顯微鏡(明場)可觀察到細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且高效表達(dá) mCherry 和 GFP 熒光，經(jīng) puromycin 篩選后用流式細(xì)胞儀檢測mCherry-GFP-LC3Ⅱ-RAW246.7陽性細(xì)胞率，結(jié)果顯示,無熒光細(xì)胞占比0%，mCherry-GFP細(xì)胞占比92.1%；GFP細(xì)胞占比7.3%；mCherry細(xì)胞占比0.6%(圖2，3)。說明成功獲得了穩(wěn)定傳代且純度較高的 mCherry-GFP-LC3Ⅱ-RAW246.7細(xì)胞株。

圖2 熒光顯微鏡下mCherry、GFP 在mCherry-GFP-LC3Ⅱ-RAW246.7細(xì)胞中的表達(dá)(200×)

2.3 自噬模型的驗(yàn)證根據(jù)mCherry-GFP-LC3Ⅱ puncta 的分布隨機(jī)選擇 10 個(gè)經(jīng) rapamycin、DMSO和 EBSS 饑餓培養(yǎng)液處理的細(xì)胞視野，通過激光共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果如圖4 所示，經(jīng)DMSO 處理的對(duì)照組中黃色熒光較少，且處于彌散狀態(tài)，而經(jīng) rapamycin和 EBSS 饑餓培養(yǎng)液處理的細(xì)胞中黃色熒光大量聚集，表明自噬形成增多，由于自噬體與溶酶體融合導(dǎo)致GFP淬滅，使自噬小體進(jìn)入第二階段(融合階段)。

Q1.無熒光細(xì)胞區(qū)；Q2.mCherry-GFP細(xì)胞區(qū)域；Q3.GFP細(xì)胞區(qū)域；Q4.mCherry細(xì)胞區(qū)域

圖4 激光共聚焦顯微鏡觀察 mCherry-GFP-LC3Ⅱ puncta 的分布

2.4 布魯菌M5疫苗株侵染后自噬特異性標(biāo)簽 mCherry-GFP-LC3Ⅱ puncta 的分布隨機(jī)選擇 10 個(gè)經(jīng)EBSS 饑餓培養(yǎng)液、布魯菌M5 疫苗株和DMSO處理的對(duì)照組細(xì)胞視野，通過激光共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果如圖 5 所示，與對(duì)照組相比，mCherry-GFP-LC3Ⅱ-RAW264.7經(jīng)EBSS饑餓培養(yǎng)液和布魯菌 M5疫苗株處理后，黃色熒光大量聚集，即mCherry-GFP-LC3Ⅱ puncta 較多，提示布魯菌 M5疫苗株可促進(jìn)自噬小體與溶酶體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞自噬進(jìn)程。

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察布魯菌M5 侵染后mCherry-GFP-LC3Ⅱ puncta 的分布

3 討論

自噬過程主要由幾個(gè)連續(xù)的步驟組成：外界刺激(主要因素有饑餓和一些病原微生物的侵襲)、轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體、降解、降解產(chǎn)物的重吸收和利用，每一個(gè)步驟都非常復(fù)雜和相互關(guān)聯(lián)[19-21]。運(yùn)用 LC3 在自噬形成過程中能發(fā)生聚集的原理，開發(fā)出 GFP-LC3 指示技術(shù)：無自噬時(shí)，GFP-LC3 融合蛋白彌散在胞漿；自噬形成時(shí)，GFP-LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，且在熒光顯微鏡下可以觀察到多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)就相當(dāng)于一個(gè)自噬體，研究人員可以通過計(jì)數(shù)斑點(diǎn)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低[22-24]。由于 GFP 是一種酸性敏感蛋白，在酸性環(huán)境下會(huì)發(fā)生淬滅，因而本試驗(yàn)構(gòu)建了 mCherry-GFP-LC3Ⅱ 雙熒光自噬標(biāo)記體系，用于標(biāo)記及和追蹤 LC3 以及自噬流的變化[25-27]。 自噬經(jīng)歷了吞噬泡、自噬小體和自噬溶酶體3個(gè)過程，當(dāng)自噬小體進(jìn)入第二階段后，與溶酶體進(jìn)行融合，即可形成自噬溶酶體[28-31]。自噬溶酶體由于其內(nèi)部呈酸性，可導(dǎo)致 GFP 淬滅，因此，GFP 的弱化可指示自噬溶酶體形成的程度，GFP 越少，說明從自噬小體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，則說明自噬小體和溶酶體融合被抑制，即自噬溶酶體進(jìn)程受阻。mCherry 自始至終都可以穩(wěn)定表達(dá)，因而研究人員能夠通過 GFP 與 mCherry 的亮點(diǎn)比例來評(píng)價(jià)自噬流的進(jìn)程。

本試驗(yàn)通過慢病毒包裝的方式獲得了含 GFP 與 mCherry 熒光雙標(biāo)的病毒，并用其感染RAW264.7，經(jīng) puromycin 篩選后，成功獲得了可穩(wěn)定傳代的mCherry-GFP-LC3Ⅱ-RAW246.7細(xì)胞株。分別用rapamycin、EBSS饑餓培養(yǎng)液、布魯菌 M5疫苗株 和 DMSO 處理 mCherry-GFP-LC3Ⅱ-RAW246.7 細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬斑點(diǎn)的形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng) rapamycin、EBSS饑餓培養(yǎng)液和布魯菌 M5疫苗株處理后的 mCherryGFP-LC3-RAW246.7 細(xì)胞綠色熒光斑點(diǎn)和紅色熒光斑點(diǎn)均明顯多于 DMSO 處理組。本試驗(yàn)中，分別隨機(jī)拍攝了 mCherry 和 GFP 熒光自噬性斑點(diǎn)，并用AimImageExaminer作圖軟件將其合并，顯示黃色的斑點(diǎn)代表自噬體，顯示紅色的斑點(diǎn)代表自噬溶酶體，可更為準(zhǔn)確、清晰和直觀的觀察自噬發(fā)生過程。

本課題組前期使用布魯菌16M侵染RAW246.7細(xì)胞，對(duì)布魯菌16M與自噬的關(guān)系進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)布魯菌16M能夠激活巨噬細(xì)胞自噬途徑[16]，而本試驗(yàn)選用的布魯菌M5疫苗株是由布魯菌16M反復(fù)傳代致弱后的疫苗株，本試驗(yàn)首次使用mCherryGFP-LC3-RAW246.7細(xì)胞株探討了布魯菌M5疫苗株和自噬的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)和布魯菌16M一樣，布魯菌M5疫苗株也能激活巨噬細(xì)胞自噬途徑。在其他病原菌如結(jié)核桿菌甚至腫瘤上等都已有使用該細(xì)胞株進(jìn)行自噬機(jī)制相關(guān)的研究。盡管自噬的發(fā)現(xiàn)已將近 60 年，但細(xì)菌引起自噬的機(jī)制、自噬在固有免疫和獲得性免疫中與細(xì)菌的相互作用以及這些過程中的信號(hào)通路及信號(hào)旁路等問題還有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)成功獲得了純度較高的 mCherry-GFP-LC3Ⅱ-RAW246.7 細(xì)胞株，可為病原微生物引起的自噬機(jī)制研究提供可靠的細(xì)胞平臺(tái)。